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    本發明提供與缺口1結合之抗體類。本發明亦提供製備該等抗體之方法、包含該等抗體之醫藥組成物、及使用該等抗體及醫藥組成物以治療疾病之方法。
    公开号:TW201302787A
    申请号:TW100146256
    申请日:2011-12-14
    公开日:2013-01-16
    发明作者:Kenneth G Geles；Bin-Bing Stephen Zhou；Lioudmila Gennadievna Tchistiakova；Yijie Gao；Joel Bard
    申请人:Wyeth Llc；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    抗缺口(notch)1抗體類
    本發明關於抗缺口(notch)1抗體類。本發明另關於使用該抗體類於治療癌之方法。
    缺口受體透過傳訊途徑控制多細胞器官中正常細胞之生長、分化及死亡，該傳訊途徑係由配體誘導之蛋白質水解引發(Bray,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7(9)：678-689,2006)。該成熟之缺口異二聚體在經三呋喃基二氫咪唑樣蛋白酶在位點S1之切割後係藉由三個Lin12/缺口重複(LNR-A、B、C)與該異二聚化(HD)結構域所組成之近膜負調節區(NRR)保持在自動抑制狀態。該HD結構域藉由在位點S1之切割被分成N端半段(HD1)及C端半段(HD2)。經由不確定之機轉，配體Delta/Serrate/Lag-2(DSL)家族與該N端結合，EGF重複區解除此抑制並在靠近C端區HD-2之S2處及在缺口(notch)之跨膜結構域內之S3處誘導二個連續額外之切割，該等切割分別係由ADAM型之金屬蛋白酶及γ分泌酶酶催化(Gordon,W.R.,et.al,Nature Structural & Molecular Biology,2007,volume 14,295-300)。後者切割釋放缺口之胞內結構域(NotchICD)，允許其轉位至該細胞核並活化靶向基因之轉錄。
    在哺乳動物細胞中，有四種已知之缺口受體。缺口1至4在胚胎及成體組織中具有廣泛、重疊之表現模式，並在造血幹細胞特化、T細胞發育、腸隱窩細胞特化及血管發育期間扮演非冗餘角色。與特定缺口1受體有關之獲得性異常已被認為與癌有關，諸如T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、乳癌及肺癌。此外，經活化之缺口1係小鼠模型中之白血病有效誘導劑，在多種實體腫瘤中過度表現，包括非小細胞肺癌、乳癌及卵巢癌。
    超過50%之T-ALL病患獲得缺口1受體之突變，其中某些突變導致該受體之組成性切割及產生缺口1ICD，部分是因為在NRR中或靠近NRR之自動抑制結構域之改變所造成之缺口1配體超敏性或配體非依賴性活化。這些突變可被分成3個主要類型。第1型突變係在HD1中之單一胺基酸取代及小型符合讀框順序地刪除或插入。第2型突變係在HD2之遠端區域中之較長插入，該插入重置該S2金屬蛋白酶切割位點至自動抑制NRR結構域以外。第3型突變亦稱為近膜延伸(JME)突變，該突變發生自使該NRR遠離細胞膜之大型插入。
    多種抑制缺口傳訊之策略被發展以用於治療癌之目的。一種方式係藉由γ分泌酶抑制劑(GSI)處理以阻斷該細胞內缺口自細胞膜之蛋白水解釋放。雖然GSI已經進入臨床階段，但它們無法辨識各缺口受體，且因為它們同時抑制缺口1及缺口2而造成小腸毒性。因此本領域仍需要新穎之抗缺口1治療，以用於治療癌同時減少不良反應，特別是小腸毒性。
    在一實施態樣中，本發明提供一種與缺口1結合之抗體，該抗體具有重鏈可變區，該重鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：71之重鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    在另一實施態樣中，本發明提供一種與缺口1結合之抗體，該抗體具有輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：97之輕鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體具有1)重鏈可變區，該重鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：71之重鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區，及2)輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：97之輕鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：71具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：71所示之重鏈可變區胺基酸序列。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：97具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：97所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：111具有至少90%一致性之重鏈胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：111所示之重鏈胺基酸序列。
    本發明亦提供與SEQ ID NO：113具有至少90%一致性之輕鏈胺基酸序列之抗體。本發明另提供包含如SEQ ID NO：113所示之輕鏈胺基酸序列之抗體。
    在另一實施態樣中，本發明提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：71具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列，及與SEQ ID NO：97具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：71所示之重鏈可變區胺基酸序列，及如SEQ ID NO：97所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    在另一實施態樣中，本發明提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：111具有至少90%一致性之重鏈胺基酸序列，及與SEQ ID NO：113具有至少90%一致性之輕鏈胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：111所示之重鏈胺基酸序列，及如SEQ ID NO：113所示之輕鏈胺基酸序列。
    在另一實施態樣中，本發明提供一種與人缺口1結合之抗體，其中該抗體與具有至少8個選自下列之胺基酸殘基之表位結合：Asn 1461、Lys 1462、Val 1463、Cys 1464、Leu 1466、Leu 1580、Tyr 1621、Gly 1622、Met 1670、Asp 1671、Val 1672、Arg 1673、Leu 1707、Ala 1708、Leu 1710、Leu 1711、Leu 1712、Leu 1713、Leu 1716及Leu 1718。
    在另一實施態樣中，本發明提供一種與缺口1結合之抗體，該抗體具有重鏈可變區，該重鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：115之重鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    在另一實施態樣中，本發明提供一種與缺口1結合之抗體，該抗體具有輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：129之輕鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體具有1)重鏈可變區，該重鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：115之重鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區，及2)輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：129之輕鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：115具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：115所示之重鏈可變區胺基酸序列。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：129具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：129所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    本發明亦提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：149具有至少90%一致性之重鏈胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：149所示之重鏈胺基酸序列。
    本發明亦提供與SEQ ID NO：151具有至少90%一致性之輕鏈胺基酸序列之抗體。本發明另提供包含如SEQ ID NO：151所示之輕鏈胺基酸序列之抗體。
    在另一實施態樣中，本發明提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：115具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列，及與SEQ ID NO：129具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：115所示之重鏈可變區胺基酸序列，及如SEQ ID NO：129所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    在另一實施態樣中，本發明提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含與SEQ ID NO：149具有至少90%一致性之重鏈胺基酸序列，及與SEQ ID NO：151具有至少90%一致性之輕鏈胺基酸序列。本發明另提供與缺口1結合之抗體，該抗體包含如SEQ ID NO：149所示之重鏈胺基酸序列，及如SEQ ID NO：151所示之輕鏈胺基酸序列。
    在另一實施態樣中，本發明提供一種與人缺口1結合之抗體，其中該抗體與具有至少8個選自下列之胺基酸殘基之表位結合：Asp 1458、Asn 1461、Val 1463、Cys 1464、Leu 1466、Leu 1580、Met 1581、Pro 1582、Tyr 1621、Gly 1622、Arg 1623、Asp 1671、Val 1672、Arg 1673、Gly 1674、Leu 1710、Gly 1711、Ser 1712、Leu 1713、Asn 1714、Ile 1715、Pro 1716及Lys 1718。
    在另一實施態樣中，本發明提供一種抗體，其相較於對天然缺口1受體之缺口1活化的抑制顯示較高之對突變缺口1受體之缺口1活化的抑制。本發明另描述之突變缺口1受體在負調節區(NRR)具有突變。在另一實施態樣中，在NRR中之突變係選自第1型、第2型或第3型突變。在另一實施態樣中，在NRR中之突變係與細胞之缺口1異常活化有關。本發明另描述之細胞為T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)細胞。本發明亦描述之T-ALL細胞係選自HPB-ALL、ALL-SIL、CCRF-CEM、MOLT-4或DND-41細胞。
    本發明亦提供與缺口1結合且與此處所描述之任一種抗體競爭與缺口1結合之抗體。
    在另一實施態樣中，本發明提供與缺口1結合之抗體，其中該抗體係IgA、IgD、IgE、IgG、或IgM同型。本發明另提供與缺口1結合之抗體，其中該同型係IgG，且其中該亞型係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或衍生自該等亞型。本發明亦提供與缺口1結合之抗體，其中該亞型係衍生自IgG1。
    在另一實施態樣中，本發明提供編碼此處所述之抗體之任一者，或編碼此處所述之抗體的重鏈及/或輕鏈之任一者之核酸。舉例來說，在一實施態樣中，本發明提供具有如SEQ ID NO：112所示之序列之核酸。在另一實施態樣中，本發明提供具有如SEQ ID NO：114所示之序列之核酸。在又一實施態樣中，本發明提供具有如SEQ ID NO：150所示之序列之核酸。在另一實施態樣中，本發明提供具有如SEQ ID NO：152所示之序列之核酸。
    在其他實施態樣中，本發明提供包含此處所描述之核酸之任一者之載體。在其他實施態樣中，本發明提供包含此處所描述之載體之任一者之宿主細胞。在其他實施態樣中，本發明提供用於產製此處所描述之抗體之任一者的方法，該方法包含培養此處所描述之任何宿主細胞及自該培養基回收該抗體。在其他實施態樣中，本發明提供重組產製此處所描述之抗體之任一者的宿主細胞。在一實施態樣中，此處所述之宿主細胞之任一者係經分離。
    在其他實施態樣中，本發明提供醫藥組成物，該醫藥組成物包含此處所述之抗體之任一者及醫藥上可接受之載劑。在其他實施態樣中，本發明提供治療有需要治療之個體的疾病之方法，該方法包含對該個體投予如此處所述之任何抗體或醫藥組成物。本發明另提供治療有需要治療之個體的疾病之方法，該疾病係與缺口1之異常活化有關，該方法包含對該個體投予此處所述之任何抗體或醫藥組成物。在另一實施態樣中，本發明提供治療有需要治療之個體的疾病之方法，諸如T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌及結腸癌，該方法包含對該個體投予此處所述之任何抗體或醫藥組成物。本發明另提供一種治療有需要治療之個體的疾病之方法，該方法包含對該個體投予此處所描述之任何抗體或醫藥組成物與一或多種治療劑之組合。
    在另一實施態樣中，本發明提供此處所揭示之任何抗體以用於治療。在其他實施態樣中，本發明提供此處所揭示之任何抗體於製造供治療之藥物之用途。在另一實施態樣中，本發明提供此處所揭示之任何抗體於治療有需要治療之個體的疾病之用途，該疾病係與缺口1之異常活化有關。在其他實施態樣中，本發明提供此處所揭示之任何抗體於治療有需要治療之個體的疾病之用途，該疾病諸如T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌及結腸癌。
    在另一實施態樣中，本發明提供與人、小鼠及馬來猴(以下簡稱為"cyno")之缺口1結合，但不與人缺口2結合之抗體。在另一實施態樣中，本發明提供與人、小鼠及cyno之缺口1結合，但不與人及小鼠之缺口3結合之抗體。 本發明之詳細說明
    本發明係關於與缺口1結合之經分離之抗體，特別是人、人化、嵌合及大鼠單株抗體。另外，本發明提供一種經分離之抗體，其相較於對天然缺口1受體之缺口1活化抑制顯示較高之對突變缺口1受體之缺口1活化抑制。本發明提供經分離之抗體及製備該等抗體及包含該等抗體之醫藥組成物之方法。本發明另關於包含該等抗體之免疫共軛物及雙特異性分子。本發明亦關於使用該等抗體以抑制缺口1活化及治療與異常細胞生長有關之各種疾病諸如癌(例如T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸癌、乳癌及卵巢癌之方法。 一般技術
    除非另外說明本發明之方法及技術通常根據該領域所廣為周知之習用方法進行，且如本說明書各處所引述及討論之各種一般性及更特別之參考文獻所述除非另外說明。見例如Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)、及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，該等參考文獻以參照方式納入此處。 定義
    「缺口1」或「缺口-1」係指人缺口1蛋白質之天然體、變異體、異構體及種同源體。舉例來說，天然人缺口1蛋白質係由前導肽、大型表皮生長因子(EGF)樣重複區、三個Lin12重複、N端異二聚結構域(HD-1)、C端異二聚結構域(HD-2)、跨膜(TM)序列及細胞內結構域(缺口1ICD)組成。全長人缺口1之NCBI/GenBank登記號係NM_017617.2。
    此處所使用之「缺口1負調節區」或「缺口1 NRR」除非另外說明，係指由三個Lin12結構域及位於該三個Lin12結構域之間的胺基酸序列所組成之缺口1的任何天然或合成之多肽區，加上缺口1之HD1及HD2結構域。在一實施態樣中，「缺口1 NRR」包括三個Lin12結構域及二個異二聚體結構域HD-1及HD-2，其中缺口1之HD-1及HD-2結構域係經共價鍵結且尚未經三呋喃基二氫咪唑樣蛋白酶切割(在S1切割之前)。在另一實施態樣中，「缺口1 NRR」包括三個Lin12結構域及二個異二聚體結構域HD-1及HD-2，其中HD-1及HD-2結構域係未共價鍵結(在S1切割之後)。在此實施態樣之一態樣中，在HD-2結構域內之S2位點未被ADAM型之金屬蛋白酶切割。在此實施態樣之另一特定態樣中，在HD-2結構域內之S2位點係經或已被ADAM型之金屬蛋白酶切割。(Gordon,W.R.,et.al,Nature Structural & Molecular Biology,2007,volume 14,295-300)。
    「抗體」係免疫球蛋白分子，其可透過位於該免疫球蛋白分子之可變區的至少一個抗原辨認區特異性地與目標結合，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此處所使用之該用語不僅包含完整多株或單株抗體，但亦包含彼之片段(例如抗原結合部分)(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈抗體(ScFv)及結構域抗體(諸如鯊魚及駱駝抗體)、包含抗體部分之融合蛋白(諸如結構域抗體)、及任何包含抗原辨認區之免疫球蛋白分子的其他經修飾之構型。抗體包括任何類型之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或彼等之亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。根據彼之重鏈的恆定結構域之抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同類型。有五種主要的免疫球蛋白類型(同型)：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些類型可進一步分成亞型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型係廣為週知。
    此處所使用之「經分離之抗體」係用於指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如與缺口1特異性結合之經分離之抗體實質上不含與除了缺口1以外之抗原特異性結合之抗體)。然而，與缺口1特異性結合之經分離之抗體可能具有與其他抗原(諸如其他物種之缺口1分子)的交叉反應性。另外，經分離之抗體可能實質上不含其他細胞材料及/或化學物。
    此處所使用之「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，即除了可能少量存在之可能天然發生之突變以外，該族群之個別組成抗體係相同的。單株抗體具高度特異性，其係以單一抗原部位為目標。
    「人化」抗體係指非人(例如鼠)抗體之形式，其為包含源自非人免疫球蛋白之最少序列之嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或彼等之片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列)。較佳地，人化抗體係其中源自接受者之互補決定區(CDR)的殘基被源自諸如具有該所欲特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔等非人物種(捐贈者抗體)之CDR的殘基所取代之人免疫球蛋白(接受者抗體)。在一些情況中，人免疫球蛋白之Fv骨架區(FW)殘基被對應之非人殘基取代。另外，該人化抗體可能包含不在接受者抗體或經導入之CDR或骨架序列中之殘基，但該些殘基被包括以進一步改善及最佳化抗體之表現。整體而言，該人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有之CDR區對應非人免疫球蛋白之CDR區且所有或實質上所有之FW區係人免疫球蛋白共同序列之FW區。該人化抗體亦將理想地包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。其他形式之人化抗體具有一或多個相對於原始抗體經改變之CDR(L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3、H-CDR1、H-CDR2或H-CDR3)，該等CDR亦被稱為「源自」原始抗體之一或多個CDR的一或多個CDR。
    「人抗體」或「全人抗體」係用來包括具有可變區之抗體，其中該骨架區及CDR區皆係源自人種系免疫球蛋白序列。另外，若該抗體包含恆定區，該恆定區亦源自人種系免疫球蛋白序列。本發明之人抗體可包括非由人種系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定點突變形成或藉由活體內體突變導入之突變)。此定義之人抗體包括含有至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽之抗體。人抗體可利用該領域已知之多種技術製備。
    用語「嵌合抗體」係用來指其中該可變區序列係源自一物種且該恆定區序列係源自另一物種之抗體，諸如其中該可變區序列係源自小鼠抗體且該恆定區序列係源自人抗體之抗體。
    此處所使用之用語「重組抗體」包括所有藉由重組方法製備、表現、產生或分離之抗體。該重組抗體具有可變區，其中該骨架區及CDR區係衍生自種系免疫球蛋白序列。然而在某些實施態樣中，該重組抗體可經活體外突變形成(或當使用Ig序列之基因轉殖動物時經活體內體突變形成)之處理，因此該重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列雖然係衍生自及關於種系VH及VL序列之序列，但不是天然存在於活體內之抗體種系庫以內之序列。
    用語「辨識抗原之抗體」及「對抗原具特異性之抗體」在此處可與用語「與抗原特異性結合之抗體」互相交換使用。
    如該領域所知，用語「Fc區」係用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區域(CH2+CH3)。該「Fc區」可能為天然序列Fc區或變異體Fc區。
    「天然序列Fc區」包含與在天然中發現之Fc區的胺基酸序列完全相同之胺基酸序列。「變異體Fc區」包含與天然序列Fc區有至少一個胺基酸修飾之差異的胺基酸序列，但仍保留該天然序列Fc區之至少一種功能。
    用語「Fc受體」或「FcR」係用於描述與抗體之Fc區結合之受體。舉例來說，該FcR可為天然序列人FcR。另外，該FcR可為與IgG抗體結合之FcR(γ受體)，其包括Fc γ RI、Fc γ RII、Fc γ RIII及Fc γ RIV亞型之受體，該些亞型包含該等受體之等位變異體及經選擇剪切之形式。FC γ RII受體包括Fc γ RIIA(「活化受體」)及Fc γ RIIB(「抑制受體」)，彼等具有類似之胺基酸序列，主要差異在於彼之細胞質結構域。活化受體Fc γ RIIA在彼之細胞質結構域中包含以免疫受體酪胺酸為基底之活化模體(ITAM)。該領域之技藝人士將了解，抑制受體Fc γ RIIB在彼之細胞質結構域中包含以免疫受體酪胺酸為基底之抑制模體(ITIM)。FcR已為該領域之技藝人士所廣為研究及熟知。其他FcR(包括該些將於未來被鑑別者)被包含在此處之用語「FcR」中。該用語亦包括新生兒受體(FcRn)，其負責轉運母體IgG至胎兒及延長IgG之半衰期。
    用語「結合」係指二種分子(例如抗原與抗體)之間的親和性。「與缺口1特異性結合」之抗體係指抗體以至少100倍或較佳地1,000倍之KD差異與包含多種不同抗原之樣本中的缺口1抗原優先結合。
    用語「高親和性」係指具有1×10-6 M或更低之KD，或更佳地具有1×10-8 M或更低之KD之抗體。親和性可利用例如表面電漿共振測量。
    「表位」包括任何能與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合之蛋白質決定簇。表位決定簇通常係由分子之化學活性表面基團組成，諸如胺基酸或糖側鏈，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。
    此處所使用之用語「kon」係用來指特定抗體-抗原交互作用之結合速率，然而此處所使用之用語「koff」係用來指特定抗體-抗原交互作用之解離速率。此處所使用之用語「KD」係用來指平衡解離常數，此常數係得自koff對kon之比(即koff/kon)，並以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可利用該領域完整建立之方法測定。一種用於測定抗體之KD之方法係藉由利用表面電漿共振，通常使用諸如Biacore®系統之生物感測器系統。
    用語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在此處可交換使用以指稱任何長度之胺基酸鏈，較佳地相對短(例如10至100個胺基酸)之胺基酸鏈。該鏈可為線性或分支，其可能包含經修飾之胺基酸及/或可能被非胺基酸中斷。應了解的是該多肽可以單鏈或相連之鏈存在。
    如該領域所知之「多核苷酸」或「核酸」在此處可交換使用，其係指任何長度之核苷酸之鏈，包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被納入鏈中之底物。
    抗體之「可變區」係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(不論單獨或組合)。如該領域所知，重鏈及輕鏈之可變區各由四個骨架區(FW)及連接該四個骨架區之亦稱為超變異區之三個互補決定區(CDR)組成。各鏈中之CDR被FW拉靠近，並與來自其他鏈中之CDR一起形成抗體之抗原結合部位。
    可變結構域之「CDR」係位於可變區內之胺基酸殘基，其係根據卡巴(Kabat)定義、柯西亞(Chothia)定義、卡巴及柯西亞二者、AbM、接觸、及/或構形定義之累積、或該領域廣為周知之任何CDR測定方法加以識別。抗體CDR可能被識別為原本由卡巴等人所定義之超變異區。見例如Kabat et al.,1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,NIH,Washington D.C.。CDR之位置亦可能被識別為最早由柯西亞等人所描述之結構性環圈。見例如Chothia et al.,1989,Nature 342：877-883。其他識別CDR之方法包括「AbM定義」，該法為卡巴法及柯西亞法之折衷，係源自利用牛津分子(Oxford Molecular)之AbM抗體模型軟體(現為Accelrys®)，或如MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.,262：732-745所述根據觀察到之抗原接觸之CDR之「接觸定義」。在此處稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可能被鑑別為對抗原結合造成焓貢獻之殘基。見例如Makabe et al.,2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。雖然其他CDR邊界定義可能不嚴格遵守上述方法中之一者，且將與至少部分之卡巴CDR重疊，不過它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用之CDR可能指由該領域已知之任何方法(包括多種方法之組合)所定義之CDR。此處所使用之方法可利用根據這些方法中任一者所定義之CDR。以包含超過一種CDR之任何給定實施態樣而言，該CDR可根據卡巴、柯西亞、延長、AbM、接觸及/或構形定義中任一者加以定義。
    抗體之「恆定區」係指抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區(不論單獨或組合)。
    「宿主細胞」包括可以或已經接受載體以導入多核苷酸插入物之個別細胞或細胞培養。宿主細胞包括單一宿主細胞之後代，且該後代可能因為天然、意外或蓄意突變而不一定與原始親代細胞完全相同(在形態學或基因學DNA互補性上)。宿主細胞包括經本發明之多核苷酸在活體內轉染之細胞。
    此處所使用之「載體」係指建構物，其能在宿主細胞中遞送及較佳地表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體、包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞諸如生產細胞。
    此處使用之「表現控制序列」係引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子或增強子。表現控制序列係可操作地與所欲轉錄之核酸序列連接。
    此處所使用之「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何當與活性成分組合時能使該成分保留生物活性且不與個體之免疫系統反應之任何物質。實例包括但不限於任何標準醫藥載劑諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液諸如油/水乳液及各種類型之潤濕劑。較佳之用於氣霧劑或非經腸投予之稀釋劑係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含該等載劑之組成物係藉由廣為周知之習用方法調製。
    「個體」或「對象」係哺乳動物，更佳者係人。哺乳動物亦包括但不限於農場動物、競賽動物、寵物、靈長動物、馬、犬、貓、小鼠及大鼠。
    「經分離之蛋白質」、「經分離之多肽」或「經分離之抗體」係指該蛋白質、多肽或抗體之來源或衍生來源(1)不與在彼之天然狀態下伴隨彼之天然相關成分相關，(2)不含來自該相同物種之其他蛋白質，(3)係由來自不同物種之細胞表現，或(4)不在天然中發生。因此，經化學合成之多肽或在不同於該多肽之天然來源細胞之細胞系統中合成之多肽將會與彼之天然相關成分「分離」。亦可藉由分離以使蛋白質實質上不含天然相關成分，即使用該領域廣為周知之蛋白質純化技術。 缺口1受體
    人缺口1 cDNA編碼2556個胺基酸殘基之蛋白質，其係由前導肽、36EGF樣重複、負調節區(NRR)、跨膜(TM)序列及胞內結構域(缺口1ICD)組成。 與NRR結合之抗缺口1抗體
    在本發明之完整考慮範圍中，以高親和性與缺口1結構域結合之抗體可減少缺口1信號傳導，因此可能顯示活體外及活體內之生物活性以抑制癌細胞生長，特別是T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、結腸癌及卵巢癌。該等抗體可根據該領域中具有一般技藝人士所知之一般方法產製。在一實施態樣中，該等抗體可經由以免疫原免疫接種大鼠，接著藉由雜交瘤選殖如此產生之抗體加以產製，並藉由各種檢測分析該經選殖之抗體。舉例來說，固相ELISA免疫分析、免疫沉澱、BIAcore、FACS、及西方墨點試驗係可被用於識別與缺口1特異性反應之抗體的多種分析。由ELISA試驗所篩選之抗體的缺口1結合親和性可在表面電漿共振Biacore®儀器設備測量。
    本發明之抗缺口1抗體可藉由上段描述之方法以外之該領域已知之任何其他方法製備。免疫接種宿主動物之途徑及時程通常與已建立及習知之抗體刺激及產製技術一致，如此處進一步描述。用於產製人及小鼠抗體之通用技術係該領域已知及/或係於此處描述。 由雜交瘤技術產製之抗缺口1抗體
    在本揭示內容之詳細考慮範圍內，任何哺乳動物個體包括人或源自該個體之抗體產製細胞可經操縱以作為產製哺乳動物(包括人)雜交瘤細胞系之基礎。通常，該宿主動物係經腹膜內、肌肉內、經口、皮下、腳掌內及/或皮內接種一定量之免疫原，包括如此處所述。
    雜交瘤可自淋巴細胞及永生化之骨髓瘤細胞製備，其使用Kohler,B.and Milstein,C.(1975)Nature 256：495-497之常規體細胞雜交技術或由Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18：377-381(1982)所改良之技術。可被用來作為抗體來源之雜交瘤包含該親代雜交瘤之所有衍生物及子細胞，該親代雜交瘤產製對缺口1具特異性之單株抗體或彼之部分。
    產製該等抗體之雜交瘤可利用已知方法在活體外或活體內生長。該單株抗體可藉由習用之免疫球蛋白純化技術自培養基或體液分離。 藉由免疫接種宿主動物所產製之抗缺口1抗體之人化
    在本揭示內容之詳細考慮範圍內，本揭示內容之抗缺口1抗體可經許多方法操作以改善彼等之生物活性及醫藥特性，其中該抗體係藉由免疫接種宿主動物以產製。其中一種操作方式係人化。
    人化抗體之方法係該領域之一般技藝人士所廣為周知。通常，要使單株抗體人化有四個基本步驟。這些步驟為：(1)測定起始抗體之輕鏈及重鏈可變結構域之核苷酸及經預測之胺基酸序列；(2)設計該人化抗體，即決定在人化過程期間將使用哪一個抗體骨架區；(3)實際人化方法/技術；及(4)轉染及表現該人化抗體。
    多種包含源自非人免疫球蛋白之抗原結合部位的「人化」抗體分子已在文獻中描述，包括具有鼠V區或經修飾之鼠V區及彼等之相關CDR融合至人恆定結構域之嵌合抗體、具有在與適當之人抗體恆定結構域融合之前使鼠CDR移植至人支持骨架區(FR)之嵌合抗體、及具有由重組工程化之鼠骨架區所支持之鼠CDR的嵌合抗體。該等「人化」分子係經設計以最小化對鼠抗人抗體分子之非所欲之免疫反應，以免限制該些基團在人接受者之治療應用的持續期間及有效性。 人抗缺口1抗體
    在本揭示內容之詳細考慮範圍中，全人抗缺口1抗體可藉由使用自商業途徑獲得之小鼠得到，該小鼠已經工程化處理以表現特定人免疫球蛋白。經設計以產生更為所欲(例如全人抗體)或更強烈之免疫反應的基因轉殖動物亦可被用於產製人化或人抗體。該等技術之實例係艾比基因(Abgenix)公司(加州費利蒙市(Fremont,CA))之XenomouseTM及美德列斯(Medarex)公司(紐澤西州普林斯頓)之HuMAb-Mouse®及TC MouseTM。
    也在本揭示內容之詳細考慮範圍內的是，全人抗缺口1抗體可依照噬菌體展示技術之一般方法經重組產製獲得，此對於該領域之技藝人士將是顯而易見。或者，噬菌體展示技術可被用來自未經免疫接種之捐贈者的免疫球蛋白可變區(V)結構域基因庫活體外產製人抗體及抗體片段。
    基因替換亦可被用於自鼠抗體衍生人抗體，其中該人抗體具有類似該起始鼠抗體之親和性及特異性。雖然上述討論係關於人化抗體及人抗體，但所討論之通用原則適用於客製化用於例如犬、貓、靈長動物、馬或牛之抗體。此處所描述之人化抗體之一或多個態樣可被組合，例如CDR移植、骨架突變及CDR突變。 重組製備之經工程化及經修飾之抗缺口1抗體
    通常，抗體可藉由將該所欲抗體之DNA序列放入表現載體，然後藉由在宿主細胞中轉染及表現加以重組製備，該宿主細胞包括但不限於本來不產製免疫球蛋白蛋白質之大腸桿菌(E.coli)細胞、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞。其他宿主細胞諸如基因轉殖植物細胞或基因轉殖乳細胞亦可被使用。
    抗體亦可經重組修飾。舉例來說，人重鏈及輕鏈恆定區之DNA可被用於取代鼠抗體DNA之同源性鼠序列，或藉由共價連接非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或部分至該免疫球蛋白編碼序列。以類似之方法，可製備具有此處之抗缺口1單株抗體之結合特異性之「嵌合」或「雜交」抗體。
    抗體可變區亦可藉由CDR移植加以修飾。由於CDR序列主要負責大部分之抗體-抗原交互作用，因此有可能藉由建構包括特定天然發生抗體之CDR序列的表現載體以表現模擬特定天然發生抗體之特性的重組抗體，該CDR序列被移植至具有不同特性之不同抗體的骨架序列上。
    因此，本揭示內容之另一態樣關於經分離之單株抗體，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含如此處所述之CDR1、CDR2及CDR3序列，該輕鏈可變區包含如此處所述之CDR1、CDR2及CDR3序列。因此，該等抗體包含如此處所述之單株抗體的VH及VL CDR序列，但是可能包含與這些抗體不同之骨架序列。該等骨架序列可得自包括種系抗體基因序列之公眾DNA資料庫或公開參考文獻。
    另一類型之可變區修飾係使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變，藉以改良該受到關注之抗體的一或多種結合特性(例如親和性)。可進行定點突變形成或PCR媒介之突變形成以導入突變，其對抗體結合或其他受到關注之功能特性之影響可利用此處所描述之活體外或活體內試驗評估。通常，保守性修飾(如下討論)係經導入。該等突變可為胺基酸取代、添加或刪除。另外，CDR區內經修飾之殘基通常不超過一、二、三、四或五個。 表位定位
    單株抗體在抗原上之結合表位可依照抗原-抗體交互作用之類型藉由多種方法定位。
    若抗體與由抗原中之連續胺基酸殘基所組成之單一表位結合，此結合通常不受抗原構形改變之影響，該結合表位被稱為線性表位。測定線性表位之胺基酸序列可藉由該領域廣為周知之技術完成。非線性表位亦稱為構型表位，其係由數個依序但非連續之區段或不連續之殘基組成，該等區段或殘基在抗原折疊成彼之天然結構時被拉近。
    構型表位之定位取決於抗體與呈天然構形之抗原之交互作用。多種該領域中廣為周知之技術可被用於測定構型表位。舉例來說，抗原-抗體複合物之共結晶、X光繞射及結構分析使抗原-抗體交互作用可視化。當配合胺基酸突變形成時，該技術可提供抗體結合表位之有力證據及生動圖像。各種抗缺口1抗體所結合之表位或表位組可根據上述定位方法或該領域廣知之其他方法測定。 保守性取代
    抗體亦可能藉由保守性取代一或多個該抗體之胺基酸殘基或藉由刪除或添加一或多個該抗體之胺基酸加以重組修飾。胺基酸序列插入包括長度介於一個殘基至包含上百個或更多殘基之多肽之胺基端及/或羧基端融合，也包括在序列內插入單一或多個胺基酸殘基。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與表位標籤融合之抗體。抗體分子之其它插入變異體包括在抗體之N端或C端融合酵素或多肽以增加該抗體於血液循環中之半衰期。
    取代變異體是使該抗體分子中之至少一個胺基酸殘基被移除且在該位置插入不同之殘基。最受到關注之取代性突變形成之位置包括超變異區，但亦可考慮FR之改變。 親和性成熟之抗缺口1抗體
    本揭示內容包括親和性成熟之實施態樣。舉例來說，親和性成熟抗體可利用該領域已知之方法產製(諸如Marks et al.(1992)Bio/Technology,10：779-783、Barbas et al.(1994)Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813、Schier et al.(1995)Gene,169：147-155、Yelton et al.(1995)J.Immunol.,155：1994-2004、Jackson et al.(1995)J.Immunol.,154(7)：3310-9、Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.,226：889-896、及PCT公開號WO2004/058184)。該等方法可被用於調整抗體之親和性及用於特徵化CDR。 抗缺口1抗體之轉譯後修飾
    抗體亦可經轉譯後修飾加以改質，包括但不限於藉由該領域已知之技術所進行之不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。
    其他轉譯後修飾之方法包括使用該領域已知之偶合技術，包括但不限於酵素方法、氧化性取代及螯合。修飾可被用於例如連接免疫測定之標記。 具有經修飾之恆定區之抗缺口1抗體
    在本發明之一些實施態樣中，該抗體包含經修飾之恆定區，諸如呈免疫惰性或部分惰性之恆定區，例如不引發補體媒介性溶解、不刺激抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、或不活化小神經膠質細胞；或在下列任一或多項具有減少之活性(相較於未經修飾之抗體)：引發補體媒介性溶解、刺激抗體依賴性細胞媒介性細胞毒性(ADCC)、或活化小神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可被用於達到效應功能之最佳量及/或組合。見例如Morgan et al.,Immunology 86：319-324(1995)、Lund et al.,J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969(1996)、Idusogie et al.,J.Immunology 164：4178-4184(2000)、Tao et al.,J.Immunology 143：2595-2601(1989)、及Jefferis et al.,Immunological Reviews 163：59-76(1998)。
    在一些實施態樣中，該抗體包含具有下列突變之人重鏈IgG1恆定區：在較低位置之絞鏈區中之L234A/L235A/G237A導致實質上減少之ADCC及CDC活性。見例如US20090155256。
    在Fc區內之修飾通常可被用來改變該抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合、及/或抗原依賴性細胞性細胞毒性。另外，本揭示內容之抗體可經化學修飾(例如可使一或多個化學基團與該抗體連接)或經修飾以改變彼之糖基化模式，以再次改變該抗體之一或多種功能特性。
    本揭示內容所考慮之另一種抗體修飾係PEG化。抗體可經PEG化以例如增加該抗體之生物(例如血清)半衰期。為了使抗體PEG化，該抗體(或彼之片段)通常會在使一或多個PEG基團變成與該抗體或抗體片段連接之條件下與聚乙二醇(PEG)反應，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物。通常，PEG化係經由與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)之醯基化反應或烷基化反應進行。此處所使用之用語「聚乙二醇」係用來包含已被用於衍生化其他蛋白質之任何形式之PEG，諸如單(C1至C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇順丁烯二醯亞胺。在某些情況中，該經PEG化之抗體係去糖基化之抗體。用於PEG化蛋白質之方法係該領域所知，且可被應用於本揭示內容之抗體。 融合蛋白質
    本發明亦包含融合蛋白質，該融合蛋白質包含一或多個本發明之抗體或多肽之片段或區域。在一實施態樣中，本發明提供包含本揭示內容之抗體的輕鏈可變區之至少10個連續胺基酸及/或重鏈可變區之至少10個胺基酸之融合多肽。在其他實施態樣中，本發明提供包含至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個輕鏈可變區之連續胺基酸及/或至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個重鏈可變區之連續胺基酸的融合多肽。在另一實施態樣中，該融合多肽包含本揭示內容之抗體的輕鏈可變區及/或重鏈可變區。在另一實施態樣中，該融合多肽包含本揭示內容之抗體的一或多個CDR。就本發明之目的而言，融合蛋白包含一或多種抗體及另一種在天然分子中並未連接之胺基酸序列，例如異源性序列或來自另一區之同源性序列。示範性異源序列包括但不限於「標籤」諸如FLAG標籤或6His標籤。
    融合多肽可藉由該領域已知之方法產製，例如合成或重組。 雙特異性分子
    本揭示內容之抗體(或彼之抗原結合部分)可被衍生化或與另一功能性分子連接，例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體之配體)以產生與至少二種不同之結合位點或靶向分子結合之雙特異性分子。本揭示內容之抗體事實上可能經衍生化或與超過一種其他功能性分子連接以產生與超過二種不同之結合位點及/或靶向分子結合之多特異性分子；該等多特異性分子亦意圖被此處所使用之用語「雙特異性分子」所包含。為了產生本揭示內容之雙特異性分子，本揭示內容之抗體可與一或多種其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合擬似物)功能性連接(例如藉由化學偶合、基因融合、非共價連接或其他方式)以產生雙特異性分子。 單鏈抗體
    本發明之抗體可為其中該重鏈及輕鏈可變區(Fv區)已藉由可彎折之連接子連接以形成單多肽鏈之單鏈抗體(scFv)，該單多肽鏈形成抗原結合區。該等單鏈抗體可藉由融合編碼肽連接子之DNA至編碼該二個可變結構域多肽(VL及VH)之DNA之間製備。根據在該二個可變結構域之間可彎折之連接子之長度，該形成之多肽可自行摺疊以形成抗原結合單體，或它們可形成多體(例如二聚體、三聚體、或四聚體)(Kortt et al.(1997)Prot.Eng.10：423；Kortt et al.(2001)Biomol.Eng.18：95-108)。藉由組合不同的含VL及VH多肽，我們可以製備與不同表位結合之多聚scFv(Kriangkum et al.(2001)Biomol.Eng.18：31-40)。單鏈抗體可利用該領域已知之多種技術製備。 免疫共軛物
    本發明之抗體可為免疫共軛物或抗體-藥物共軛物(ADC)。免疫共軛物結合單株抗體之結合特異性與與化學治療劑之作用。 編碼抗缺口1抗體之多核苷酸
    本發明亦提供編碼本發明之抗體及肽之經分離之多核苷酸，及包含該多核苷酸之載體及宿主細胞。
    在一態樣中，本發明提供包含本發明之多核苷酸之任一者之組成物(諸如醫藥組成物)。在一些實施態樣中，該組成物包含表現載體，該表現載體包含編碼本發明之抗體之多核苷酸。在其他實施態樣中，該組成物包含表現載體，該表現載體包含編碼本發明之抗體或多肽之任一者之多核苷酸。
    在另一態樣中，本發明提供製備此處所述之多核苷酸之任一者之方法。
    與任何該等序列互補之多核苷酸亦包含於本發明中。多核苷酸可能為單股(編碼或反義)或雙股，且可能為DNA(基因組、cDNA或合成性)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子及mRNA分子，該HnRNA分子包含內含子且以一對一之方式對應DNA，該mRNA分子不包含內含子。額外之編碼或非編碼序列可能但不需要存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可能但不需要與其他分子及/或支持物質連接。
    多核苷酸可能包含天然序列(即編碼抗體或彼之部分之內源性序列)或可能包含該序列之變異體。多核苷酸變異體包含一或多個取代、添加、刪除及/或插入以使該經編碼之多肽的免疫反應性相對於天然免疫反應性分子而言不被減少。對該經編碼之多肽的免疫反應性之影響通常係如此處所述檢測。變異體較佳地展現與編碼天然抗體或彼之部分之多核苷酸序列具有至少約70%之一致性，更佳地至少約80%之一致性，甚至更佳地至少約90%之一致性及最佳地至少約95%之一致性。
    當二個多核苷酸或多肽序列係經排比以得到最高對應性且該二個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同時，該二個序列被稱為「一致」。
    該領域之一般技藝人士將瞭解的是，由於基因密碼簡併之結果，有許多核苷酸序列編碼此處所描述之多肽。這些多核苷酸中有些與任何天然基因之核苷酸序列具有極低之同源性。然而，本發明特別考慮因為使用不同的密碼子而有所差異之多核苷酸。另外，包含此處所提供之多核苷酸序列之基因的等位基因係屬於本發明之範圍內。等位基因係因為一或多個突變，諸如核苷酸之刪除、添加及/或取代而被改變之內源性基因。該形成之mRNA及蛋白質可能但不一定具有經改變之結構或功能。等位基因可利用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)加以識別。
    本發明之多核苷酸可利用化學合成、重組方法或PCR獲得。
    在利用重組方法製備多核苷酸時，包含所欲序列之多核苷酸可被插入適當之載體中，該載體接著可被導入適當之宿主細胞以供複製及擴增。適當之選殖載體可根據標準技術建構，或可選自該領域為數眾多之可用選殖載體。雖然該經選擇之選殖載體可能因所意圖使用之宿主細胞而異，適用之選殖載體通常具有自我複製之能力、可能具有特定限制內切酶之單一目標及/或可能帶有可用於選擇含有該載體之克隆的標誌基因。
    表現載體通常是可複製之多核苷酸建構物，其包含本發明之多核苷酸。這暗示表現載體必需能在宿主細胞中以附加體或染色體DNA之組成部分被複製。載體成份通常包括但不限於下列一或多項：信號序列、複製起點、一或多種標誌基因、適當之轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。
    含有感興趣之多核苷酸之載體可藉由任何適當之方法導入宿主細胞，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染、微彈撞擊、脂質體轉染及感染(例如該載體為感染性劑諸如牛痘病毒)。導入載體或多核苷酸之選擇通常將視該宿主細胞之特徵而定。
    本發明亦提供包含此處所述之任何多核苷酸之宿主細胞。任何能過度表現異源性DNA之宿主細胞可被使用以分離編碼該感興趣之抗體、多肽或蛋白質之基因。適當之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草桿菌)及酵母菌(諸如啤酒釀母菌、分裂酵母(S.pombe)或乳酸克魯維酵母菌(K.lactis))。較佳地，該宿主細胞以相較於該對應之感興趣之內源性抗體或蛋白質若存在於宿主細胞中高出約5倍、更佳為高出10倍、甚至更佳為高出20倍之量表現cDNA。 醫藥組成物
    在另一態樣中，本發明提供一種組成物，例如醫藥組成物，該組成物包含與醫藥上可接受之載劑一起調製之一種或經組合之本發明之單株抗體(或彼之抗原結合部分)。該等組成物可包括一種或經組合之(例如二或多種不同)本發明之抗體、或免疫共軛物或雙特異性分子。舉例來說，本發明之醫藥組成物可包含與靶向抗原上之不同表位結合或具有互補活性之抗體(或免疫共軛物或雙特異性分子)之組合。
    本發明之醫藥組成物亦可在組合療法中投予，即與其他劑組合。舉例來說，該組合療法可包括本發明之抗缺口1抗體與至少一種其他抗發炎劑、抗癌劑或免疫抑制劑之組合。可被用於組合療法之治療劑之實例係於下節本發明之抗體之用途中更詳細地描述。
    本發明所使用之「醫藥上可接受之載劑」包括任何和所有溶劑、分散媒質、塗料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收遲延劑、及生理上可互容之類似者。通常，該載劑係適合用於靜脈、肌肉、皮下、非經腸、脊椎或表皮投予(例如藉由注射或輸注)。根據投予之途徑而定，該活性化合物(即抗體、彼之抗原結合部分、免疫共軛物、或雙特異性分子)可被包覆於一材料中以保護該化合物不受可能不活化該化合物之酸及其他天然條件之作用。
    在某些實施態樣中，本發明之抗體可以中性形式(包括兩性離子形式)存在或呈帶正電或帶負電之物種。在一些情況中，該抗體可與反離子複合以形成醫藥上可接受之鹽。因此，本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥上可接受之鹽。
    「醫藥上可接受之鹽」係指保有該母體化合物(例如抗體)之所欲生物活性且不給予非所欲毒性效應之鹽(見例如Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。舉例來說，用語「醫藥上可接受之鹽」包括含有一或多種抗體及一或多種反離子之複合物，其中該反離子係源自醫藥上可接受之無機及有機酸及鹼。
    該等鹽之實例包括酸添加鹽及鹼添加鹽。酸添加鹽包括該些源自非毒性無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及該類似物)之鹽，以及源自非毒性有機酸(諸如脂肪族一元及二元羧酸、經苯基取代之烷基烷酸、羥基烷基烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸及該類似物)之鹽。鹼添加鹽包括該些源自鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及類似物)之鹽，以及源自非毒性有機胺(諸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因及該類似物)之鹽。
    另外，醫藥上可接受之無機鹼包括金屬離子。金屬離子包括但不限於適當之鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽及其他生理上可接受之金屬離子。源自無機鹼之鹽包括鋁、銨、鈣、鈷、鎳、鉬、釩、錳、鉻、硒、錫、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳鹽、亞錳、鉀、銣、鈉及鋅且呈彼等之平常價數。
    本發明之抗體之醫藥上可接受之酸添加鹽可自下列酸製備，包括但不限於甲酸、乙酸、乙醯胺基苯甲酸、己二酸、抗壞血酸、硼酸、丙酸、苯甲酸、樟腦二酸、碳酸、環己烷氨基磺酸、去氫膽酸、丙二酸、乙二胺四乙酸、乙硫酸、芬地柞酸、偏磷酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、單寧酸、檸檬酸、硝酸、抗壞血酸、葡萄糖醛酸、順丁烯二酸、葉酸、反丁烯二酸、丙酸、丙酮酸、天冬胺酸、麩酸、苯甲酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、離胺酸、異檸檬酸、三氟乙酸、雙羥萘酸、丙酸、鄰胺苯甲酸、甲基磺酸、乳清酸、草酸、草乙酸、油酸、硬脂酸、水楊酸、胺基水楊酸、矽酸、p-羥基苯甲酸、菸鹼酸、苯乙酸、扁桃酸鹽、雙羥萘酸、磺酸、甲磺酸、磷酸、膦酸、乙磺酸、乙二磺酸、銨、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、甲苯磺酸、2-羥基乙磺酸、磺胺酸、硫酸、硝酸、亞硝酸、硫酸一甲基酯、環己基胺基磺酸、β-羥基丁酸、甘胺酸、甘胺醯基甘胺酸、麩酸、二甲次砷酸、二胺基己酸、樟腦磺酸、葡萄糖酸、硫氰酸、酮戊二酸、吡哆醛5-磷酸鹽、氯苯氧基乙酸、十一酸、N-乙醯基-L-天冬胺酸、半乳糖二酸及半乳糖醛酸。
    醫藥上可接受之有機鹼包括三甲胺、二乙胺、N,N-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、膽鹼、二苯甲基胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)、普魯卡因、環形胺、四級銨陽離子、精胺酸、甜菜鹼、咖啡鹼、氯苄咪唑、2-乙基胺基乙醇、2-乙基胺基乙醇、2-甲基胺基乙醇、乙二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、乙基葡糖胺、還原葡糖胺、葡萄糖胺、組胺酸、海巴明、咪唑、異丙基胺、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、吡啶、吡哆醇、釹、哌啶、多胺樹脂、普魯卡因、嘌呤、可可鹼、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、胺基丁三醇、甲胺、牛磺酸、膽酸鹽、6-胺基-2-甲基-2-庚醇、2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇、2-胺基-2-甲基-1-丙醇、脂肪族一元及二元羧酸、經苯基取代之烷基烷酸、羥基烷基烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族磺酸、鍶、三(羥甲基)甲基甘胺酸、肼、苯基環己胺、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、二(2-羥基乙基)胺基-三(羥基甲基)甲烷、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸、1,4-哌嗪二乙磺酸、3-嗎啉-2-羥基丙磺酸、1,3-二[三(羥基甲基)甲基胺基]丙烷、4-嗎啉丙磺酸、4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-乙磺酸、2-[(2-羥基-1,1-二(羥基甲基)乙基)胺基]乙磺酸、N,N-二(2-羥基乙基)-2-胺基乙磺酸、4-(N-嗎啉)丁磺酸、3-(N,N-二[2-羥基乙基]胺基)-2-羥基丙磺酸、2-羥基-3-[三(羥基甲基)甲基胺基]-1-丙磺酸、4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-(2-羥基丙磺酸)、哌嗪-1,4-二(2-羥基丙磺酸)二水合物、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪丙磺酸、N,N-二(2-羥基乙基)甘胺酸、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)、N-[三(羥基甲基)甲基]-3-胺基丙磺酸、N-三(羥基甲基)甲基-4-胺基丁磺酸、N-(1,1-二甲基-2-羥基乙基)-3-胺基-2-羥基丙磺酸、2-(環己基胺基)乙磺酸、3-(環己基胺基)-2-羥基-1-丙磺酸、3-(環己基胺基)-1-丙磺酸、N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸、4-(環己基胺基)-1-丁磺酸、N-[三(羥基甲基)甲基]甘胺酸、2-胺基-2-(羥基甲基)-1,3-丙二醇、及胺基丁三醇。
    本發明之醫藥組成物亦可包括醫藥上可接受之抗氧化劑。醫藥上可接受之抗氧化劑實例包括：(1)可溶於水之抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏二亞硫酸鈉、亞硫酸鈉及該類似物；(2)可溶於油之抗氧化劑，諸如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基羥基甲氧苯(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、天然維生素E(alpha-tocopherol)及該類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及該類似物。
    可用於本發明之醫藥組成物中之適當水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及該類似物)、多元醇之適當混合物、蔬菜油(諸如橄欖油)、及注射型有機酯諸如油酸乙酯。適當之流動性可藉由使用例如包覆材料(諸如卵磷酯)、藉由維持分散液所需之顆粒大小及藉由使用界面活性劑加以維持。
    該些組成物亦可包含佐劑諸如保存劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。防止微生物之存在可藉由同上之滅菌程序及藉由包含各種抗細菌及抗真菌劑(例如苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及該類似物)二種方式加以確保。在組成物中包括等張劑諸如糖、氯化鈉及該類似物亦為所欲。此外，延長該注射型醫藥劑型之吸收可藉由包括延遲吸收之劑達成，諸如一硬脂酸鋁及明膠。
    醫藥上可接受之載劑包括無菌水性溶液或分散劑及用於立即製備無菌注射溶液或分散劑之無菌粉末。該等用於醫藥活性物質之介質及劑之用途係為該領域所知。除非任何習用介質或劑與該活性化合物不相容，彼於本發明之醫藥組成物中之用途係經考慮。補充性活性化合物亦可被納入於該等組成物之中。
    治療組成物通常在製造及儲存的條件下必須為無菌及穩定。該組成物可被調製為溶液、微乳化物、脂質體、或其他適合高藥物濃度之有序結構。載劑可為溶劑或分散介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及該類似物)、及彼等之適當混合物。藉由例如使用包覆劑諸如卵磷脂、藉由維持在分散液中需要之顆粒大小及藉由使用界面活性劑可維持適當之流動性。於許多情況下，較佳的是該組成物包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇)、山梨糖醇或氯化鈉。延長注射型組成物之吸收可藉由在該組成物中包含延長吸收之劑質例如單硬脂酸鹽及明膠以達成。
    無菌注射溶液之製備可藉由將所需量之活性化合物及視需要之一或多種上述成分納入適當溶劑，接著經過無菌微過濾。通常，製備分散液係藉由將該活性化合物併入無菌載體中，該無菌載體含有基本之分散媒質和取自上述列舉成分之其他所需成分。對於供製備無菌注射溶液之無菌粉末而言，製備之方法包括但不限於真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)以自彼等之先前經無菌過濾之溶液產生活性成分連同任何額外所欲之成分之粉末。
    可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分的量，將視接受治療之個體及特定投服模式而定。可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分的量通常將是可產生治療效果之組成物的量。通常，以百分率而言，此量將為自約0.01%至約99%之活性成分，較佳自約0.1%至約70%，最佳自約1%至約30%之活性成分與醫藥上可接受之載劑之組合。
    給藥方案係經調整以提供最佳之所欲反應(例如治療反應)。舉例來說，可給予單次注射、在一段時間內給予數次分開投藥或可視該治療情況之危急性而按比例減少或增加投藥。特別有利的是將非經腸組成物調製成易於投予及劑量一致之劑量單位形式。此處所使用之劑量單位形式係指適合作為個體治療之統一劑型之物理分離單位；各單位包含經計算以產生該所欲治療效果之預先決定量之活性化合物以及該所需之醫藥載劑。本發明之劑量單位形式的規格將取決並與下列直接相關：(a)該活性化合物之獨特特徵及所欲達成之特定治療效果，及(b)合成該用於治療個體之敏感性之活性化合物的固有技藝之限制。
    在投予抗體時，該劑量介於約0.0001至100毫克/公斤，及更常為自0.01至5毫克/公斤之宿主體重。舉例來說，劑量可為0.3毫克/公斤體重、1毫克/公斤體重、3毫克/公斤體重、5毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重或介於1至10毫克/公斤之範圍內。示範性治療療法需要每周一次、每二周一次、每三周一次、每四周一次、每個月一次、每三個月一次、或每三至六個月一次之投予。本發明之抗缺口1抗體的給藥方案包括例如經靜脈投予1毫克/公斤體重或3毫克/公斤體重，抗體之投予係利用下列投藥計畫之一：(i)每四周投予一次共投予六次，接著每三個月投予一次；(ii)每三周投予一次；(iii)投予3 mg/kg體重一次，接著每三周投予1 mg/kg體重。
    在一些方法中，二或多種具有不同結合特異性之單株抗體係同時給予，其中每種抗體投予之劑量落在所顯示之範圍。抗體通常在多種情況下投予。單次劑量之間的間隔可為例如每周、每月、每三個月或每年。間隔亦可能不規則，如藉由測量抗病患體內之標靶抗原的抗體之血中量而定。在一些方法中，劑量係經調整以達到約1至1000微克/毫升之血漿抗體濃度，在一些方法中約為25至300微克/毫升。
    或者，抗體可以持續釋放調製劑之形式投予，在此情況下所需之投予次數較少。劑量及頻率視抗體在病患體內之半衰期而異。一般來說，人抗體之半衰期最長，次之為人化抗體、嵌合抗體、及非人抗體。投予之劑量及頻率將視該治療係預防性或治療性而有所不同。在預防性應用中，相對低之劑量將以相對不頻繁之間隔長期投予。有些病患終其一生將持續接受治療。在治療性應用中，有時候需要在相對較短之間隔使用相對較高之劑量直到疾病惡化減少或停止，較佳地直到病患顯示疾病之症狀部分或完全改善。之後，該病患可被給予預防性療法。
    在本發明之醫藥組成物中之活性成分的實際劑量可能互有不同，以獲得就特定病患、組成物及投予模式而言能有效達成該所欲之治療反應的活性成分之量，而不造成對病患之毒性。該經選擇之劑量將視各種藥物動力學因素而定，包括本發明所採用之特定組成物(或彼之酯、鹽或醯胺)的活性、投予途徑、投予時間、所採用之特定化合物的排泄速率、治療期間、與所採用之特定組成物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療之病患的年齡、性別、體重、條件、整體健康及醫學病史及醫學領域中廣為周知之類似因素。
    本發明之抗缺口抗體之「治療有效劑量」較佳地導致疾病症狀之嚴重性減少、無疾病症狀期之頻率及期間增加、或預防因疾病折磨所致之障礙或失能。舉例來說，在治療缺口1陽性之腫瘤方面，「治療有效劑量」較佳地抑制相對於未治療之個體至少約20%之細胞生長或腫瘤生長、更佳地至少約40%、甚至更佳地至少約60%、及仍更佳地至少約80%。化合物抑制腫瘤生長之能力可於預測人腫瘤之療效的動物模型系統中評估。或者，此組成物之性質可藉由檢測該化合物抑制之能力評估，諸如該領域之技術人士所熟知之活體外抑制試驗測量。治療有效量之治療化合物可減少腫瘤大小，或以其他方式改善個體之症狀。具該領域一般技藝之人士將可根據諸如個體(體型)大小、個體症狀之嚴重性及該選擇之特定組成物或投予途徑等因素來決定該量。
    本發明之組成物可使用一或多種該領域已知之多種方法經一或多種投予途徑投予。如該領域之技藝人士所了解的，該投予之途徑及/或模式將視所欲之結果而定。本發明之抗體的投予途徑包括例如藉由注射或輸注之靜脈內、肌肉內、皮內、腹腔內、皮下、脊椎或其他非經腸投予途徑。此處所使用之「非經腸投予」係指除經腸及局部投予以外之通常藉由注射之投予模式，包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、脊椎鞘內、囊內、眼眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、關節內、囊下、蛛網膜下腔、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。或者，本發明之抗體或彼之抗原結合部分可經由非經腸之途徑投予，諸如局部、表皮或黏膜途徑投予，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、經舌下或局部。
    該活性化合物可與防止該化合物快速釋放之載劑一起製備，諸如控制釋放調製劑，包括植入物、經皮貼片、及微膠囊釋放系統。可使用可生物降解、生物相容性之聚合物，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、及聚乳酸。許多用於製備該調製劑之方法具有專利或廣為該領域之技術人士所知。見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。 本發明之用途及方法
    本發明之抗體(特別是人抗體)、抗體組成物及方法具有多種關於缺口1媒介疾病之診斷及治療的活體外及活體內之診斷及治療用途。舉例來說，這些分子可被投予至培養細胞(試管內或活體外)或人類個體(例如活體內)，以治療、預防及診斷多種疾病。此處所使用之用語「個體」係意圖包括人及非人動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳類及非哺乳類，諸如非人靈長動物、羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類及爬蟲類。較佳之個體包括具有由缺口1活性所媒介之疾病的人病患。該方法特別適合用於治療具有與異常缺口1表現或活化有關之疾病的人病患。當抗缺口1之抗體係與另一劑一起投予時，該二者可按任何順序或同時投予。
    由於本發明之抗體對缺口1具有結合特異性，本發明之抗體可被用來特異性檢測細胞表面之缺口1表現，另外可被用於經由免疫親和性純化以純化缺口1。
    另外，本發明之抗體、抗體組成物及方法可被用於治療異常缺口1表現(例如癌)之個體。在一特定實施態樣中，該癌係T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)。在另一特定實施態樣中，該癌係非小細胞肺癌(NSCLC)、乳癌、結腸癌或卵巢癌。
    可由本發明之抗體治療之其他類型之異常缺口1表現包括例如間皮瘤、肝膽(肝臟及膽道)、原發性或繼發性中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性或繼發性腦瘤、肺癌(NSCLC及SCLC)、骨癌、胰癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚黑色素瘤、眼內黑色素瘤、直腸癌、肛門區之癌、胃癌、胃腸(胃、結直腸、及十二指腸)、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門癌、霍奇金氏(Hodgkin’s)症、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌、輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、腦下垂體腺瘤、腎上腺皮質癌、膽囊癌、多發性骨髓瘤、膽管癌、纖維肉瘤、神經胚細胞瘤、或一或多種前述癌之組合。
    本發明之抗體組成物(例如人單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫共軛物)之適當活體內及活體外投予途徑係該領域所廣為周知且可由該領域之技藝人士選擇。舉例來說，該等抗體組成物可藉由注射(例如經靜脈或皮下)投予。所使用之分子的適當劑量將視該個體之年齡及體重和該抗體組成物之濃度及/或調製而定。
    本發明之人抗缺口1抗體可與一或多種其他治療劑共投，例如細胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑。該抗體可與該劑連接(成為免疫複合物)或可與該劑分開投予。在後者(分開投予)之情況中，該抗體可在該劑投予之前、之後或同時投予，或可與其他已知之治療共投，例如抗癌治療，例如放射線。該抗體及該劑可被製備為供同時、依序或分開投予。該等治療劑包括(除其它者外)抗癌劑諸如多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)(甲烯土黴素(adriamycin))、順鉑(cisplatin)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)、卡氮芥、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、及羥脲，這些抗癌劑本身只有在對病患有毒性或次毒性之量時才有效。順鉑(cisplatin)可經靜脈投予100毫克/劑量每四周一次，甲烯土黴素(adriamycin)係經靜脈投予60至75毫克/毫升劑量每21天一次。本發明之人抗缺口1抗體與化學治療劑之共投提供二種經由不同機轉產生對人腫瘤細胞之細胞毒性效應之作用的抗癌劑。 套組
    亦屬於本發明之範圍內的是包含本發明之抗體組成物(例如人抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫共軛物)及使用說明之套組。該套組可進一步包含一或多種額外之劑(諸如免疫抑制劑、細胞毒性劑或放射毒性劑)，或一或多種本發明之額外抗體(例如具有互補活性之人抗體，其與缺口1抗原上異於第一人抗體之表位結合)。
    因此，以本發明之抗體組成物治療之病患可經額外投予(在投予本發明之人抗體之前、同時或之後)另一治療劑，諸如細胞毒性劑或放射毒性劑，以促進或增強該人抗體之治療效應。
    本發明繼續以下列實施例說明，該些實施例不應被視為進一步之限制。所有圖表及在本說明書中各處所引述之所有參考文獻、專利及公開專利申請案之內容係明確地藉由參照方式納入此處。 實施例1 產製重組人及小鼠缺口1蛋白質免疫原 A.人及小鼠缺口1 NRR蛋白質之表現及純化
    編碼缺口1 NRR區(如表1顯示之人缺口1之SEQ ID 2之胺基酸及小鼠缺口1之SEQ ID 6之胺基酸)且具有N端信號肽及C端Avi及His6標籤之cDNA建構體被選殖至表現載體pSMED2。這些建構體被過渡性轉染至COS或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，該經分泌至條件培養基中之蛋白質在SDS-PAGE上分析。在S1切割位點經處理後，該缺口1 NRR結構域之N端約26 kDa之半(LNR-A、B、C及HD1)和C端約12 kDa之半(HD2及Avi_His標籤)經由非共價交互作用維持相連以形成異二聚體複合物，如圖1所示。缺口1 NRR之S1處理經測定約佔自CHO細胞製備之樣本中之50%或更少。
    為了增進在S1切割位點之處理，該缺口1 NRR表現建構體係經轉染至CHO-PACE細胞(Harrison et,al,Semin Hematol.1998 Apr；35(2 Suppl 2)：4-10)，並選擇具有缺口1 NRR之最高表現及完全處理之穩定細胞系。這些細胞系之培養的規模被放大以收集可自其中純化缺口1 NRR蛋白質之條件培養基(CM)。
    經濃縮之CHO-PACE CM被裝填至27毫升之Qiagen Ni-NTA Superflow管柱，該管柱在4℃經流速1ml/min之PBS平衡。在裝填後，該管柱以10倍管柱體積(CV)之PBS清洗，接著以10CV之緩衝液A(300mM NaCl,50mM Na2HPO4,pH 8.0)沖洗，再以10CV 4%緩衝液B(500mM imidazole,300mM NaCl,50mM Na2HPO4,pH 8.0)沖洗。該人缺口1 Avi_His係利用在10CV內到達100%緩衝液B之線性梯度洗脫。含有人缺口1 Avi_His之組分被集合、過濾及透析至不含鈣鎂(CMF)之PBS中。該蛋白質接著繼續經二次大小排除層析純化，利用經TBS+1mM CaCl2,0.1mM ZnCl2平衡之Superdex-200及Superdex-75串聯管柱進行(總CV=600ml)。經純化之人及小鼠缺口1 NRR_Avi_His標籤蛋白質之SDS-PAGE分析顯示>90%之經純化之蛋白質被正確切割成該預測大小之缺口1 NRR N端肽及C端肽。經純化之人及小鼠缺口1 NRR蛋白質之光散射(SEC-MALs)分析顯示在自然條件下之大小排除管柱上之40 kDa預期分子量之尖峰，顯示該等蛋白質正確形成完整之缺口1 NRR異二聚體。 B.馬來猴缺口1 NRR-Fc融合蛋白質之表現及純化
    編碼馬來猴缺口1 NRR區(如表1顯示之馬來猴缺口1之SEQ ID 10之胺基酸)且具有N端信號肽及C端人IgG1 Fc片段之cDNA建構體被選殖至表現載體pSMED2。此建構體與可溶性PACE過度表現之建構體一起被過渡性共轉染至293細胞(英維特基(Invitrogen)公司)(Harrison et,al,Semin Hematol.1998 Apr；35(2 Suppl 2)：4-10)以確保馬來猴缺口1 NRR區之完整處理。自該經轉染之細胞收集條件培養基，並經由蛋白質A親和性純化方法純化該馬來猴缺口1 NRR-Fc融合蛋白質。經純化之蛋白質接著被透析至含1mM CaCl2之TBS中。SDS-PAGE分析顯示二個預期大小12Kd(HD1)及37Kd(HD2+Fc)之多肽片段，該蛋白質製劑之純度>95%。在天然條件下之分析性SEC顯示大約50 KD之單一尖峰，此代表上述二個片段之異二聚體，且在該製劑中之聚集量極少(<1%)。
    下表1提供人、小鼠及馬來猴缺口1 NRR區之胺基酸及核苷酸序列。
    實施例2 大鼠抗缺口1抑制抗體之產製、選殖及人化 A.免疫接種及雜交瘤產製
    將實施例1所描述之人及小鼠免疫原共注射至史-道二氏(Sprague-Dawley)大鼠以產製雜交瘤。史-道二氏(Sprague-Dawley)大鼠藉由皮下注射含有各20微克之人及小鼠缺口1 NRR_Avi_His重組蛋白質於弗氏(Freund’s)完全佐劑之混合物加以免疫接種。免疫接種以2周間隔重複進行12周。第一次注射後之第0、35、49及63天所收集之血清樣本藉由如下述之酶連接免疫吸附測定(ELISA)檢測循環中之抗缺口1抗體力價活性。
    當達到理想力價時，最終劑量之蛋白質混合物經靜脈(尾靜脈)注射至該具有理想抗體力價之大鼠，在4天後犧牲該鼠以收集脾細胞。利用PEG 4000，使該大鼠之全脾細胞(2×10E08)與小鼠骨髓瘤細胞系P3X63.Ag8.653(2.5×10E07)融合。經融合之細胞被接種於96孔盤(0.2毫升/孔)，並經HAT篩選(含有5×10E-04 M次黃嘌呤、1.6×10E-05 M胸苷、4×10E-04 M胺喋呤、及20%熱不活化之FCS之RPMI 1640)之處理。
    經融合14天之後，雜交瘤上清液係經收集及測試大鼠IgG之存在，該大鼠IgG藉由如下所述之ELISA展現與人及/或小鼠缺口1 NRR重組蛋白質及與U-2 OS細胞表面上所表現之全長缺口1之結合活性。顯示具有與缺口1標靶結合之活性的上清液被進一步測試彼等在如下所述之報告基因測試中阻斷缺口1媒介性傳訊活性之能力。經選擇之缺口1傳訊阻斷克隆接著被次選殖以進一步分析。 B.缺口1特異性抗體之篩選及選擇 1.重組蛋白質結合ELISA
    雜交瘤培養之上清液首先藉由ELISA篩選與重組人及小鼠免疫原之結合。經純化之人或小鼠缺口1 NRR_Avi_His標籤蛋白係經包覆於CoStar高結合性96孔ELISA盤上，以1微克/毫升之濃度於含鎂/鈣之100微升PBS中包覆隔夜。該盤以PBS-Mg/Ca清洗並以1% BSA於PBS-Mg/Ca中封閉1小時。將盤中之封閉溶液倒掉，加入雜交瘤培養上清液至該盤。在室溫中培養1小時後，再次以PBS-Mg/Ca清洗該盤，然後才加入於封閉緩衝液中稀釋(1：20,000)之經HRP共軛之二級抗體。當該經測試之一級抗體係大鼠IgG時，該二級抗體係山羊抗大鼠IgG Fc(貝瑟生技(Bethyl Biotech)公司)；當該一級抗體係小鼠IgG時，該二級抗體係山羊抗小鼠IgG Fc(賽默科技(Thermal Scientific)公司)。
    在經二次抗體培養1小時之後，再次如上述清洗該盤，並添加TMB受質溶液。允許呈色反應進行10分鐘，然後加入停止溶液0.18M H2SO4。在O.D.450 nM之吸光度係經測量，資料經作圖及以微軟Excel及Graphpad-Prizm軟體分析。對人及/或小鼠缺口1 NRR展現結合活性之抗體係經選擇以進行如下所述之以細胞為基底之ELISA。 2.以細胞為基底之ELISA
    於上述以重組缺口1 NRR為基底之ELISA中與免疫原呈陽性結合之克隆的上清液接著於以細胞為基底之ELISA中篩選其與細胞表面缺口1之結合。在細胞表面上穩定過度表現人或小鼠全長缺口1蛋白質之U-2 OS細胞在ELISA分析前一天以50,000細胞/孔接種於96孔盤(白色不透明，BD/VWR)。在ELISA當天，自孔槽中移除培養基，經連續稀釋(1：3於封閉緩衝液中)之抗體溶液或雜交瘤培養上清液係經施用於孔盤。孔盤於室溫中培養2小時，之後以PBS-Mg/Ca清洗。經HRP共軛之二級抗體接著如上述用於重組蛋白質ELISA中被施用及培養於細胞中1小時。孔盤先經PBS-Mg/Ca清洗，接著以Pico化學發光劑呈色套組(賽默科技(Thermal Scientific)公司)呈色，按照廠商說明進行化學發光測量。資料作圖及分析係利用微軟Excel及Graphpad-Prizm軟體進行。此資料被用於篩選雜交瘤克隆及特徵化親代大鼠及人化抗體，如下列實施例中描述。 3.報告基因測試
    與免疫原顯示陽性結合之克隆的上清液接著於人及小鼠缺口1報告基因共培養測試(RGA)中篩選中和活性。篩選之結果被用於選擇初代克隆。
    人缺口1報告細胞係經胰蛋白酶消化，自培養盤收集於完全麥考伊(McCoy’s)5A培養基中(McCoy’s 5A與10% FBS及青黴素、鏈黴素，英維特基(Invitrogen)公司)並加以計數。適當細胞稀釋液係以相同培養基製備，以允許在含有經連續稀釋(1：3於完全McCoy’s 5A培養基中)之抗體溶液或雜交瘤培養上清液之96孔盤(白色不透明，BD/VWR)上，每孔80微升之總體積中有每孔3,000個細胞。該等細胞及抗體稀釋液之混合物係在孔盤上於細胞培養箱(37℃，5% CO2)中培養1小時，接著在各孔中添加每孔15,000個人DLL4-HEK293細胞。在添加hDLL4-HEK293細胞後，該盤於培養箱中繼續培養20小時，按照廠商說明使用Dual-Glo螢光素酶測試系統(普羅麥加(Promega)公司)以測量螢火蟲螢光素酶及內部對照水母冷光酶活性。資料係利用微軟Excel及格飛派德軟體(GraphPad Prism)作圖及分析。小鼠缺口1報告基因共培養測試係如人缺口1報告基因共培養測試所述進行，除了使用每孔20,000個小鼠缺口1報告細胞與每孔40,000個小鼠DLL4-HEK293細胞共培養。 C.選殖及定序
    經證實具有細胞表面結合或中和活性之初代克隆被次選殖，諸如以下進一步描述之克隆438及351。如下所述自該等亞克隆萃取RNA，並經由RT-PCR選殖獲得該經表現之抗體的可變區DNA序列。
    一至五百萬個經次選殖之雜交瘤細胞係經均質化以利用凱杰(Qiagen)公司RNAeasy Mini套組進行總RNA分離。接著利用SuperScript III RT套組(英維特基(Invitrogen)公司)製備第一股cDNA。抗缺口1 IgG之可變區的雙股cDNA接著藉由如下所述之PCR產製及擴增，使用大鼠IgG重鏈(IgG1、2a、2b)及輕鏈(κ或λ)恆定區之引子。PCR循環條件：1個循環於95℃ 1分鐘；25個循環於95℃ 1分鐘、63℃ 1分鐘及72℃ 1分鐘。該形成之RT-PCR產物被選殖至TOPO-Blunt選殖載體(英維特基(Invitrogen)公司)並以習用方法定序。
    親代大鼠438及親代大鼠351之可變區(V)(以下分別稱為「大鼠438」及「大鼠351」)的cDNA被次選殖至哺乳動物表現載體，其中大鼠可變區重鏈(VH)符合讀框地與小鼠IgG1(mIgG1)融合，大鼠可變區輕鏈(VL)符合讀框地與小鼠κ融合。類似地，為了產製具有大鼠V區及人IgG恆定區之嵌合抗體，大鼠VH及VL係分別與人IgG1(hIgG1)及人κ符合讀框地融合。對應之嵌合抗體係藉由過渡性轉染這些建構體於COS細胞中產製，彼等之結合及中和活性係於試驗中證實。
    經純化之大鼠可變區-小鼠恆定區嵌合抗體(以下稱為「大鼠438-mIgG1」及「大鼠351-mIG1」)進一步於一系列活體外及活體內試驗中特徵化，包括如以下實施例所述之重組抗原及細胞表面標靶結合、於RGA及血管生成試驗中抑制缺口1活性、及小鼠模型之腫瘤生長抑制。該前導抗體大鼠438及大鼠351係根據這些試驗篩選。表2列出大鼠438及大鼠351之可變區及額外克隆90、132、132(A12/G11)及137之各種區的胺基酸及核酸序列。
    D.大鼠438及大鼠351之人化
    大鼠438及大鼠351係經人化及進一步發展以提供人化單株抗體438及351(以下分別稱為「人化438」及「人化351」)。在較低之絞鏈區具有使hIgG1之效應功能不活化之3個突變(L234A/L235A/G237A)之人IgG1重鏈恆定區與人κ輕鏈恆定區被用來作為該人化438抗體及人化351抗體之恆定區。大鼠438及大鼠351可變區之人化係利用CDR移植策略實施。
    表3提供人化438變異體及人化351變異體之各種區的胺基酸及核酸序列。該先導人化438變異體在測試後經測定為VH1.1/VL1.8。人化438 VH1.1/VL1.8具有如SEQ ID NO：71所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：97所示之輕鏈可變區。以人化438變異體而言，該VH 1.0及1.1變異體之CDR區相同，且該VL 1.0、1.1、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.10及1.11變異體之CDR區相同。該先導人化351變異體在測試後經測定為VH1.0/VL1.1。人化351 VH1.0/VL1.1具有如SEQ ID NO：115所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO：129所示之輕鏈可變區。以人化351變異體而言，該變異體VL 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、及1.7之CDR區相同。
    含有人接受體骨架(重鏈之DP54及輕鏈之DPK9)與相關CDR捐贈者序列之cDNA係由GeneArt公司合成。經合成之cDNA產物係經次選殖及符合讀框地分別與哺乳動物表現載體pSMED2中之人IgG1-3m恆定區及pSMN2中之人κ融合成重鏈及輕鏈。人接受體骨架、大鼠438及人化438變異體之VH與VL之排比，及人接受體骨架、大鼠351及人化351變異體之VH與VL之排比係顯示於下表4。卡巴定義之CDR係以畫底線表示。以351VH及351VL而言，骨架區中之小寫字母表示大鼠351與人化351變異體之間的殘基差異。
    人接受體骨架區與大鼠438可變區之接受體骨架區之間有顯著同源性，VH為78%及VL為61%。同樣地，人接受體骨架區與大鼠351可變區之接受體骨架區之間也有顯著同源性，VH為76%及VL為61%。
    在人化期間，CDR移植抗體可能導致喪失該原始抗體之活性。骨架區中之差異可能造成該形成之人化438及人化351抗體具有經改變之構形，在人接受體骨架中導入經選擇之回復突變成原始抗體以恢復該活性及結合表位。表5顯示在人接受體骨架中經選擇之回復突變成該對應位置之大鼠438及大鼠351殘基以最佳化該活性及結合表位。
    實施例3 抗缺口1抑制抗體之特徵 A.表現及與缺口1之結合
    人化438及人化351變異體之相對表現產率係於COS細胞之暫時表現試驗中測試。如表6所示，多種人化438變異體(包括人化438 VH1.1/VL1.8)及多種人化351變異體(包括人化351 VH1.0/VL1.1)顯示超過30微克/毫升之顯著產率。
    在條件培養基中IgG之總表現量係藉由定量IgGELISA測量，如實施例2中描述。表7顯示自人化438變異體及大鼠438和人化351變異體及大鼠351之細胞表面缺口1結合ELISA計算之EC50(nM)值。
    該資料顯示多種人化438之變異體(包括人化438 VH1.1/VL1.8)在與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1之結合上與大鼠438類似。另外，表7顯示人化438 VH1.1/VL1.8與VH1.1/VL1.3二者完全保有大鼠438與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之小鼠缺口1的交叉反應性。
    該資料另外顯示人化351 VH1.0/VL1.1及VH1.1/VL1.4在與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1之結合上與大鼠351類似。表7另外顯示人化351 VH1.0/VL1.1及VH1.1/VL1.4完全保有大鼠351與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之小鼠缺口1的交叉反應性。
    B.競爭性ELISA
    人化438變異體與經生物素基化之大鼠438之間以及人化351變異體與經生物素基化之大鼠351之間的競爭性ELISA係於重組或細胞表面表現之全長人缺口1上實施。以重組蛋白質或細胞為基底之ELISA所述之類似方式，將96孔細胞培養盤分別包覆缺口1 NRR_Avi_His蛋白質(高結合性co-Star孔盤)，或接種全長缺口1表現U-2 OS細胞(細胞培養盤Co-star)。含有0.8 nM之生物素基化大鼠438或生物素基化大鼠351抗體之抗體溶液或細胞培養條件培養基經連續稀釋(1：3於封閉液)後被施用至孔盤。
    在培養2小時後，該孔盤如上述清洗，並加入以封閉液稀釋5000倍之經HRP共軛之鏈黴抗生物素蛋白(南方生技(Southern Biotech)公司)。待與鏈黴抗生物素蛋白之培養進行30分鐘後，再次清洗孔盤，並以TMB溶液顯色10分鐘。顯色反應以添加0.18M H2SO4停止，並測量450 nM之吸光度。資料作圖及分析係利用微軟Excel及Graphpad-Prizm軟體進行。
    表8顯示人化438變異體與生物素基化大鼠438抗體競爭與重組人缺口1 NRR免疫原結合之競爭性ELISA之EC50(nM)值。該資料顯示多種人化438之變異體(包括人化438 VH1.1/VL1.8)在競爭性ELISA中具有與未經標示之大鼠438類似之EC50值。此表示該人化438變異體和未經標示之大鼠438一樣，均與生物素基化大鼠438競爭與缺口1 NRR免疫原之結合。這些結果顯示人化438變異體和大鼠438抗體皆與免疫原上相同或類似之表位結合。
    表8另外顯示人化438變異體和生物素基化大鼠438抗體競爭與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1結合之競爭性ELISA之EC50(nM)值。該資料顯示多種人化438之變異體(包括人化438 VH1.1/VL1.8)在競爭性ELISA中具有與未經標示之大鼠438類似之EC50值。此表示該人化438變異體和未經標示之大鼠438一樣，均與生物素基化大鼠438競爭與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1之結合。這些結果顯示人化438變異體和大鼠438抗體皆與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1上相同或類似之表位結合。
    表9顯示人化351變異體和生物素基化大鼠351抗體競爭與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1結合之競爭性ELISA之EC50(nM)值。該資料顯示多種人化351之變異體(包括人化351 VH1.0/VL1.1)在競爭性ELISA中具有與未經標示之大鼠351類似之EC50值。此表示該人化351變異體和未經標示之大鼠351一樣，均與生物素基化大鼠351競爭與細胞表面上所表現之全長人缺口1之結合。這些結果顯示人化351變異體和大鼠351抗體皆與U-2 OS細胞之細胞表面上所表現之全長人缺口1上相同或類似之表位結合。
    C.與其他人缺口同源物結合之特異性
    其他缺口受體家族成員在生物程序中扮演重要角色。舉例來說，缺口2缺損導致小鼠模型中之胚胎死亡。相反地，缺口3缺損僅在末端動脈導致輕微表型，缺口4缺損在小鼠模型中導致無法檢測之表型。缺口1 NRR區之最近同源物係缺口2及缺口3(約50%同源性)，缺口4係較遠之同源物(34%同源性)。抗缺口1抗體與缺口家族之其他成員(特別是缺口2)的交叉反應性可能在病患導致非所欲之效應。因此，大鼠438與人化438以及大鼠351與人化351抗體與其他缺口家族成員之間可能的交叉反應性係經測試。
    編碼與人IgG1 Fc片段融合之人缺口2及缺口3 NRR區的表現建構體被穩定導入CHO-PACE細胞中。收集這些細胞表現NRR-Fc融合物之條件培養基。人缺口2 NRR-Fc及人和小鼠之缺口3 NRR-Fc係藉由蛋白質A親和性接著大小排除層析(SEC)純化。經純化之製劑係經透析至含1mM CaCl2之TBS中，並於分析性SEC上分析得到>99%之純度。
    如表10所示，大鼠438與人缺口2 NRR-Fc融合蛋白質缺乏可檢測之結合。表10另外顯示，人化438變異體缺乏與U-2 OS細胞表面上所表現之全長人缺口3之可檢測之結合，表示438不與缺口3交叉反應。
    如表11所示，人化351 VH1.0/VL1.1缺乏與人缺口2 NRR-Fc融合蛋白、人及小鼠缺口3 NRR-Fc融合蛋白可檢測之結合。然而，人化351 VH1.0/VL1.1與人、小鼠及馬來猴缺口1 NRR交叉反應。
    D.與人缺口1 NRR之結合親和性
    抗缺口1 NRR交互作用之動力學常數係藉由表面電漿共振(Biacore® T100，Biacore公司，紐澤西州皮斯卡塔威(Piscataway,NJ))測定。CM5晶片之流動池係經大約10,000共振單位(RU)之抗人IgG-Fc(Biacore®)於10mM甘胺酸pH 5.0中以10微升/分鐘固定600秒。於含1mM CaCl2之TBS中稀釋之10微克/毫升之抗缺口1人化438變異體及人化351變異體係以10微升/分鐘被捕捉。與四種濃度(自3.7至100nM)及濃度為零(流動緩衝液)之人缺口1 NRR_Avi_His重組蛋白質於100微升/分鐘之結合係於含1mM CaCl2之TBS中記錄3分鐘。該複合物之解離係經測量10分鐘。晶片表面藉由以10微升/分鐘注射3M MgCl2與3mM EGTA達60秒以再生。在減去參考物及緩衝液信號後所得到之曲線利用Biacore® T100評估軟體(Biacore®)帶入1：1蘭繆爾(Langmuir)結合模型。
    經選擇之人化438變異體、人化351變異體及A2抗體(Wu,Y.et al.,Nature 464：1052-1057,2010)與人缺口1 NRR蛋白質之結合親和性係經測定並顯示於表12。Biacore之動力學分析顯示經選擇之人化438變異體(包括VH1.1/VL1.8及VH1.1/VL1.3)相較於A2抗體具有類似之ka(on)及kd(off)速率。
    Biacore之動力學分析另外顯示大鼠351和經選擇之人化351變異體(包括VH1.0/VL1.1及VH1.1/VL1.4)相較於A2抗體具有較高之ka(on)及kd(off)速率。雖然大鼠351和經選擇之人化351變異體得到之KD值類似，但在ka(on)及kd(off)速率所顯示之差異可能對以下實施例所描述之缺口1依賴性傳訊之不同中和活性有所影響。
    D.熱穩定性
    蛋白質或蛋白質結構域之熱穩定性與該蛋白質或蛋白質結構域之穩定性成正向相關。較高熔點之蛋白質或蛋白質結構域通常提供較佳之可製造性及較長之貨架時間。示差掃描量熱儀(DSC)被用於檢測人化438變異體及大鼠438-mIgG1之熱穩定性。蛋白質樣本被稀釋於體積250微升之PBS中成為0.3毫克/毫升。該對應之調製空白緩衝液被用來作為參照樣本。二個樣本皆利用設定至8℃之MicroCal ThermoVac樣本脫氣恆溫機(Microcal,Inc.,Northampton,MA)徹底脫氣。樣本係經分注至MicroCal VP-DSC毛細池微量熱計(MicroCal,Inc.,Northampton,MA)之適當池中。樣本係於15℃平衡4分鐘，接著以每小時100℃之速率掃瞄至100℃。選擇20秒之過濾期。原始資料係經基準校正，該蛋白質濃度係經正常化。Origin軟體(OriginLab Corporation,Northampton,MA)被用於適配該資料至具有適當數量之同類鹼基置換之MN2-State模型。
    如下表13所示，所有人化438變異體在彼等之Fab區相較於大鼠438-mIgG1具有較高之熱穩定性，即具有較高之熔點(皆高於77℃)。
    實施例4 識別抗缺口1抑制抗體在缺口1 NRR上之結合表位 A.結構域交換嵌合性建構體
    如實施例3所述，人化438及人化351變異體缺乏與缺口3蛋白質之交叉反應性。製備缺口1及缺口3 NRR之結構域交換嵌合性建構體以進行抗缺口1大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1及A2抗體之表位定位。編碼具有C端Fc融合(人IgG1 Fc片段)之人缺口3-缺口1(以下稱為缺口3-1)NRR區結構域交換嵌合物的表現建構體係經個別轉染至CHO-PACE，並建立表現各種嵌合物之穩定庫。源自各穩定細胞庫之條件培養基被施用至蛋白質A親和性層析，接著進行大小排除層析(SEC)以純化該嵌合性融合蛋白質。經純化之製劑接著被透析至含1mM CaCl2之TBS中，並於分析性SEC上分析。圖2顯示用於表位定位大鼠351-mIgG1、大鼠438-mIgG1及A2之重組人缺口1 NRR及缺口3 NRR結構域交換嵌合性建構體。如圖2所示，該重組NRR嵌合性蛋白質係由各種與人Fc(未顯示)融合之缺口3(以灰色顯示)及缺口1(以黑色顯示)結構域組成。
    大鼠438-mIgG1及大鼠351-mIgG1對於缺口3-1 NRR結構域交換嵌合體之相對結合能力利用Biacore® SPR技術測試，並測試該抗體之相對共振單位(RU)結合能力。大鼠438-mIgG1及大鼠351-mIgG1與缺口3-1 NRR嵌合體之SPR結合係由表面電漿共振測定(Biacore® 3000,BIAcore Inc.,Piscataway,NJ)。CM5晶片之流動池係經各約10,000 RU之抗鼠IgG(山羊)及作為對照之山羊IgG於10mM甘胺酸pH 5.0中以10微升/分鐘固定600秒。含0.1mM CaCl2之HBS-P中稀釋至1微克/毫升之大鼠438-mIgG1及大鼠351-mIgG1抗體係以10微升/分鐘捕捉300秒。各抗體之大約捕捉係150 RU(反應1)。接著，在相同緩衝液中之10微克/毫升缺口3-1 NRR嵌合體被以10微升/毫升注射300秒至該經捕捉之大鼠438-mIgG1及大鼠351-mIgG1抗體上，並測量該經經捕捉之缺口3-1 NRR(反應2)。各循環後之複合物解離係利用10 mM Ac pH 1.5以30微升/分鐘進行20秒。
    如圖2所示，大鼠438-mIgG1及大鼠351-mIgG1與缺口1 NRR之結構域的表位結合特徵係與A2和缺口1 NRR之結構域的結合特徵不同。更特別地，A2與NRR之結合相較於大鼠438-mIgG1更依賴LNR-B結構域。此外，大鼠351-mIgG1與該缺口1 NRR之結合相較於A2較不依賴LNR-A及LNR-B結構域。結構域結合特徵之差異加上在缺口1 NRR中之接觸殘基差異之更詳細資訊，以及如下述之共結晶結構所顯示之缺口1 NRR與大鼠438-mIgG1及A2連接之不同方向性，顯示大鼠438-mIgG1和A2以不同之方式與缺口1 NRR交互作用。 B. X光結晶學分析
    大鼠438及大鼠351係如上實施例2所述之表現及純化。Fab(抗原結合片段)係自大鼠438及大鼠351產製，使用皮爾斯(Pierce)公司之Fab製備套組(固定化木瓜酶)產品編號44685。大鼠438及大鼠351係以固定化木瓜酶於37℃培養24小時。Fab藉由經50 mM Tris pH 8.0平衡之Zeba管柱(Pierce)去鹽純化。自經50 mM Tris pH 8.0平衡之Q FF管柱之流出液收集Fab。
    將該形成之Fab片段與人缺口1 NRR蛋白質以1：1.2之莫耳比混合，添加0.9 mM CaCl2，在以S200大小排除管柱純化前於冰上培養30分鐘，該管柱經25 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl及0.9 mM CaCl2平衡。來自含有該Fab：NRR複合物之主要波峰的組分係經匯合及利用10 KD閥值Vivaspin HY濃縮機(Sartorius)濃縮至11 mg/ml。該Fab：NRR複合物利用懸滴蒸氣擴散法結晶化。
    以大鼠438而言，需要使用胰凝乳酶對該複合物進行限制性蛋白水解以獲得結晶。該複合物首先與胰凝乳酶混合至終濃度2微克/毫升，接著與等體積之孔槽溶液組合，該孔槽溶液係由100 mM二甲次砷酸鈉pH 5.5、14-20% PEG 8000及100至200 mM乙酸鈣組成。結晶在一周內出現，並持續成長3周。以大鼠351而言，該複合物係與等體積之孔槽溶液組合，該孔槽溶液係由20% PEG 3350及200 mM硫酸鈉組成。結晶在一周後出現，並持續成長3周。
    晶體藉由添加25%甘油至孔槽溶液中作為冷凍保護。X光資料係以先進光子源之SER-CAT射束線22BM用於大鼠438及22ID用於大鼠351收集，使用HKL-2000(HKL軟體公司)軟體套組處理至2.6埃之解析度。該結構利用Phaser軟體藉由分子置換加以解出。下列結構之搜尋模型分別為：缺口1 NRR取自pdb id 3L95、大鼠438之重鏈取自2HRP及輕鏈取自1xgp、及大鼠351之重鏈取自1BM3及輕鏈取自3L95。該形成之模型係利用包括軟NCS限制之coot及BUSTER(Global Phasing,Ltd.)重建及改良。該結構係利用molprobity驗證。在交互作用中涉及之殘基係利用pymol及PISA軟體決定。
    在人缺口1 NRR上之大鼠438表位的結構圖係如圖3所示，在人缺口1 NRR上之大鼠351表位係如圖4所示。類似之X光結晶學分析係利用A2抗體之公開資料完成，圖5顯示在人缺口1 NRR上之A2表位的結構圖。以圖3至5而言，在該抗體3.8埃以內之胺基酸殘基係以黑色顯示。下表14提供涉及缺口1 NRR抗體與大鼠438、大鼠351及A2之交互作用的殘基。
    該資料顯示大鼠438及A2與缺口1 NRR內重疊但不同之表面結合。二種表位皆包括中央HD結構域。大鼠438及A2與LNR-A交互作用，然而大鼠438與較大表面交互作用。只有大鼠438與S1環區交互作用，只有A2與LNR-B交互作用。更特別地，該資料顯示大鼠438與人缺口1 NRR殘基Asn 1461、Lys 1462、Val 1463、Cys 1464、Leu 1466、Leu 1580、Tyr 1621、Gly 1622、Met 1670、Asp 1671、Val 1672、Arg 1673、Leu 1707、Ala 1708、Leu 1710、Leu 1711、Leu 1712、Leu 1713、Leu 1716及Leu 1718結合。
    該資料亦顯示大鼠351及A2與缺口1 NRR內重疊但不同之表面結合。特別是，只有大鼠351與S1環區交互作用，只有A2與LNR-B交互作用。大鼠351及A2皆與LNR-A交互作用，然而大鼠351與LNR-A胺基酸之不同亞群交互作用。更特別地，該資料顯示大鼠351與人缺口1 NRR殘基Asp 1458、Asn 1461、Val 1463、Cys 1464、Leu 1466、Leu 1580、Met 1581、Pro 1582、Tyr 1621、Gly 1622、Arg 1623、Asp 1671、Val 1672、Arg 1673、Gly 1674、Leu 1710、Gly 1711、Ser 1712、Leu 1713、Asn 1714、Ile 1715、Pro 1716、及Lys 1718結合。
    與缺口1 NRR結合之大鼠438及大鼠351殘基之x光晶體結構利用PISA程式進一步分析。該資料顯示大鼠438與殘基Lys1718及Arg1673形成強烈靜電交互作用(鹽橋)。與該大鼠438抗體形成氫鍵之缺口1 NRR殘基係Asn1461、Asp1671、Arg1673、Leu1713、Lys1718、Cys1464、Ala1708、及Ser1712。在與大鼠438抗體形成複合物時，貢獻超過40埃2之包埋表面積之缺口1 NRR殘基係源自與重鏈交互作用之Arg1673、Val1463、Lys1462、Gly1622、Asp1671，及源自與輕鏈交互作用之Leu1466、Lys1718、Gly1711、Cys1464、Pro1716、及Val1463。在經識別之殘基當中，大鼠438與人缺口1 NRR之至少Asn1461、Val1463、Lys1462、Asp1671、Arg1673、Leu1713、及Lys1718殘基結合。
    該資料顯示大鼠351與殘基Asp1458及Arg1673形成強烈靜電交互作用(鹽橋)。與該大鼠351抗體形成氫鍵之缺口1 NRR殘基係Asp1458、Val1463、Cys1464、Ser1465、Tyr1621、Asp1671、Val1672、Arg1673、Gly1711、Ser1712、Leu1713、及Asn1714。在與大鼠351形成複合物時，貢獻超過40埃2之包埋表面積之缺口1 NRR殘基係源自與輕鏈交互作用之Val1463、Cys1464、Leu1466、Gly1711、Asn1714、Pro1716、及Lys1718，及源自與重鏈交互作用之Asn1461、Leu1580、Asp1671、及Arg1673。在經識別之殘基當中，大鼠351與人缺口1 NRR之至少Asp1458、Val1463、Tyr1621、Asp1671、Val1672、Arg1673、Ser1712、及Leu1713殘基結合。另外，A2不與殘基Asp1458、Val1463、Tyr1621、Asp1671、Val1672、Arg1673、Ser1712、及Leu1713交互作用。

    圖6顯示與大鼠438及A2抗體結合之人缺口1 NRR之結構疊加，該人缺口1 NRR係位於底下。該大鼠438及A2之重鏈係以黑色顯示，灰色之輕鏈係在兩重鏈之間。如圖6所示，大鼠438及A2抗體相對於該NRR之方向性旋轉幾乎180度，以使大鼠438之輕鏈N端指向LNR-A，然而A2之輕鏈指向LNR-C(在缺口1 NRR之背區)。此使得該重鏈被放在以NRR之角度來看之二個輕鏈的相反側。因此該A2重鏈係位於該輕鏈相對於S1環之相反側。
    圖7顯示與大鼠351及A2抗體(顯示為分子表面)結合之人缺口1 NRR(顯示為緞帶)之結構疊加。大鼠351及A2之重鏈係以黑色顯示。大鼠351之輕鏈係以暗灰色顯示，A2之輕鏈係以淡灰色顯示。圖7顯示大鼠351及A2抗體以相反方向結合，確認彼等與獨特之表位相連。 實施例5 抗缺口1抑制抗體於細胞基底試驗中之功能特徵 A.於缺口1報告基因試驗中之EDTA處理
    在缺乏配體之情形下，該經S1切割之異二聚體缺口1受體在細胞膜處維持不活化。該缺口1 NRR結構域藉由埋藏切割位點2(S2)，因此防止金屬蛋白酶之靠近以採取自動抑制構形。該缺口1 NRR結構域經由非共價交互作用相連，該交互作用係藉由二價陽離子諸如鈣穩定。然而，該缺口1 NRR結構域之抑制交互作用可藉由螯合劑EDTA被中斷。EDTA與鈣之螯合導致胞外域自該細胞膜快速脫落，且足以活化缺口1傳訊(Rand et al.,Mol.Cell.Biol.20(5)：1825-35,2000)。
    為了測定抗缺口1抑制抗體是否能在二價陽離子螯合時穩定該缺口1 NRR於不活化之構形，缺口1-報告細胞(見下節B)係與大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1、A2抗體及對照抗球蟲抗體預先培養，接著以5 mM EDTA處理。人缺口1報告細胞以每孔40,000個細胞被接種於白色壁96孔盤，並於麥考伊5A培養基、10% FBS、青/鏈黴素/麩醯胺酸中隔夜培養。吸取移除培養基，以含有0、0.01、0.1、1、10及30 μg/ml之大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1、A2抗體、及對照抗球蟲抗體之培養基取代，並於室溫中培養1小時。在經1小時之抗體預先處理後，添加EDTA至細胞中使其終濃度成為5 mM並於37℃之5% CO2中培養6小時。使用Dual-Glo螢光素酶測試系統(普羅麥加(Promega)公司)以測量8xCSL螢火蟲螢光素酶(經缺口1誘導)及水母冷光酶(組成性)報告子之活性。將源自螢火蟲螢光素酶之螢光讀數除以水母冷光酶之讀數以計算缺口1傳訊之量。計算源自各處理之3次重複測量值的平均值及標準差並予以作圖。
    表15顯示以濃度漸增之大鼠438-mIgG1、大鼠351-mlgG1、A2抗體、及對照抗球蟲抗體所實施之缺口1報告基因試驗，同時有螯合劑EDTA存在但無配體存在。該資料顯示僅添加EDTA至該缺口1報告細胞系刺激該螢火蟲螢光素酶報告基因之活化(見0 μg/ml之條件)。如預期般，該對照抗球蟲抗體不抑制缺口1傳訊。相反地，在EDTA存在之條件下，經漸增濃度之大鼠438-mIG1、大鼠351-mIgG1及A2抗體預先處理之細胞各以劑量依賴性方式抑制該螢火蟲螢光素酶報告基因之活化。在1 μg/ml、10 μg/ml及30 μg/ml之濃度下，大鼠351-mIgG1、大鼠438-mIgG1及A2處理之螢火蟲對水母螢光素酶之比係顯著低於對照抗球蟲抗體，表示對缺口1傳訊之抑制。
    B.用於缺口1報告基因共培養試驗之細胞系建構
    抗缺口1人化438及人化351抗體之抑制活性係於如實施例2所述之缺口1報告基因共培養試驗中測試。人化438及人化351抗體係與缺口1報告細胞預先培養，接著與DLL4-HEK293細胞共培養以活化缺口1傳訊或與親代HEK293細胞共培養以作為對照。
    為了產製該缺口1報告細胞系，在U-2 OS人骨肉瘤細胞系(美國菌種保存中心(ATCC)，Manassas,VA)連續實施三次穩定轉染。第一次轉染使用以pCMV6-Entry-Myc-Flag骨架(Origene公司)為基礎表現全長人缺口1或小鼠缺口1之載體，在二者中缺口1插入物之正確DNA序列係經證實。在經TransIT-LT1轉染試劑(Mirus,Madison,WI)之轉染後，U-2 OS細胞係於G418中篩選並分離克隆株。第二，穩定表現缺口1之U-2 OS克隆經pGL4.27[luc2P/minP/Hygro]載體(Promega,Madison,WI)之再轉染，該載體含有8份串聯之CSL增強子序列(CGTGGGAAAAT)，以潮黴素B加上G418篩選並分離克隆株。該8xCSL螢火蟲螢光素酶報告建構體係對經活化之缺口1傳訊有反應(例如見Jeffries et al.,Mol.Cell.Biol.22(11)：3927-3941,2002)。第三，該缺口1-pGL4.27 U-2 OS細胞經pGL4.74[hRluc/TK]載體(Promega)加線性嘌呤黴素(puromycin)標誌(Clontech,Mountain View,CA)之再轉染，並於嘌呤黴素、潮黴素B及G418中篩選及分離克隆株。該pGL4.74載體編碼水母冷光酶基因，該水母冷光酶基因係自HSV-TK啟動子組成性表現並作為內部對照。該經三重穩定轉染之U-2 OS細胞系(在此稱為「缺口1報告細胞」)被維持於含有10% FBS、1X青黴素/鏈黴素/L-麩醯胺酸(吉布可(Gibco)公司)、0.25 mg/ml G418硫酸鹽、0.3 mg/ml潮黴素B及0.001 mg/ml嘌呤黴素之McCoy’s 5A培養基中(Gibco,Grand Island,NY)。
    為了產製配體表現細胞，HEK293細胞(ATCC)係經表現人DLL4或小鼠DLL4之載體轉染。二種載體皆以pCMV6-AC-HA-His骨架為基礎(Origene,Rockvi1le,MD)，該DLL4插入物之正確DNA序列係經證實。在轉染後，HEK293細胞係於0.5 mg/ml G418中篩選，克隆株係經分離、擴增及分析DLL4之表現。在U-2 OS細胞中具有高DLL4表現及誘導高度缺口1報告活性之克隆被用來評估抗缺口1抗體之抑制效應。
    將源自螢火蟲螢光素酶之螢光讀數除以內部對照水母冷光酶之讀數以正常化該信號(在此處稱為「F/R比」)。為了計算缺口1傳訊之誘導倍數，自該DLL4-HEK293共培養報告試驗所產生之F/R比係除以源自親代HEK293共培養之F/R比，並稱為相對螢光素酶單位(RLU)或活性。
    人化438 VH1.1/VL1.8及A2於人及小鼠缺口1報告共培養測試中之力價顯示以劑量依賴性方式有效抑制缺口1之傳訊。圖8及9顯示人化438 VH1.1/VL1.8及大鼠438抗體分別於人及小鼠缺口1報告細胞中對缺口1依賴性傳訊之中和活性。在人及小鼠缺口1依賴性傳訊報告試驗中，人化438 VH1.1/VL1.8與大鼠438皆顯示相等之中和活性。因此，人化438 VH1.1/VL1.8完全保留大鼠438之中和活性。
    大鼠438-mIgG1及人化438變異體之IC50(nM)值係自該缺口1報告基因共培養測試中之缺口1依賴性傳訊之抑制計算，如下表16中所示。人化438 VH1.1/VL1.8顯示對人及小鼠缺口1傳訊二者之最大抑制，以在所有人化438變異體中最低之IC50值表示。
    大鼠351及A2抗缺口1抗體在共培養報告試驗中之抑制效應係藉由添加自約0.01 nM至200 nM之漸增濃度之抗體檢測。為了計算經抗缺口1抗體處理之共培養的抑制百分比(%)，源自漸增濃度之抗體處理的RLU係利用公式(1-(經處理/未經處理)＊100)除以未經處理之對照。
    大鼠351及A2抗體於人及小鼠缺口1報告共培養試驗中之力價顯示大鼠351對缺口1傳訊之獨特中和活性。如圖10、11及表17所示，大鼠351及A2二者以劑量依賴性方式抑制缺口1傳訊，具有自缺口1報告共培養試驗所計算之類似IC50值。圖10及表17顯示當抗體濃度大於IC50值之20倍時，A2在人缺口1報告共培養試驗中達到約100%之缺口1傳訊之最大抑制(平頂抑制)。相反地，大鼠351達到僅約85%之最大抑制，該抑制低於在A2觀察到之最大抑制。大鼠351無法達到100%之最大抑制，即使抗體濃度為IC50值之250倍。圖11及表17顯示在小鼠缺口1報告共培養試驗中觀察到類似結果。A2在小鼠缺口1報告共培養試驗中達到約86%之缺口1傳訊之最大抑制。相反地，大鼠351達到僅約55%之最大抑制，該抑制低於在A2觀察到之86%最大抑制。
    圖12及13分別顯示人化351變異體及大鼠351-mlgG1於人及小鼠缺口1依賴性傳訊報告試驗中之中和活性。表18提供自缺口1報告基因共培養試驗之缺口1依賴性傳訊之抑制所計算之人化351變異體、大鼠351-mIgG1及A2之IC50(nM)值。該資料顯示人化351 VH1.0/VL1.1顯現與大鼠351-mIgG1及大鼠351類似之中和活性。人化351 VH1.0/VL1.1達到約87.4%之最大缺口1傳訊抑制，該抑制低於在A2觀察到之最大抑制。
    實施例6 克隆351之中和活性的結構及功能基礎
    在缺口1 NRR中與各個LNR-A、B及C結構域結合之Ca2+係維持缺口1 NRR結構之完整性所需。舉例來說，藉由添加EDTA至缺口1表現細胞之培養基中移除Ca2+，導致該缺口1 NRR結構之去穩定性。此導致暴露出在缺口1 NRR中之S2金屬蛋白酶切割位點及活化缺口1傳訊(Rand et al.,Mol.Cell.Biol.20(5)：1825-35,2000)。
    大鼠351 Fab與人缺口1 NRR之共結晶結構在單一晶體中具有四個獨立複合物。然而，該四個複合物中只有一個包含該預期之與LNR-A結合之Ca2+。圖14A顯示在複合物1之LNR-A區中大鼠351與人缺口1 NRR之交互作用。在此結構中，缺口1 NRR之帶負電殘基Asp1458與存在此結構中之鈣具有離子交互作用。圖14B顯示在複合物2之LNR-A區中大鼠351與人缺口1 NRR之交互作用。複合物2係複合物2至4之代表圖。複合物2至4不具有與鈣之離子交互作用，取而代之的是該人缺口1 NRR之Asp1458與大鼠351 VH CDR2中之帶正電殘基Arg58形成鹽橋。此表示該大鼠351之帶正電Arg58係與該帶正電之Ca2+競爭與該人缺口1 NRR之帶負電Asp1458之結合。
    為了顯示該帶正電殘基Arg58對大鼠351之功能特性的重要性，產製突變大鼠351-mIgG1抗體，其中VH中之Arg58係突變為中性殘基Tyr(及Arg58-Tyr與Val60-Ala或Arg之組合)。該突變大鼠351-mIgG1抗體係於缺口1傳訊抑制報告試驗中測試，結果顯示於圖15及表19。如圖表所示，大鼠351達到僅約87%之最大抑制，然而突變大鼠351-mIgG1及A2分別達到~95%及~98%之較高最大抑制。
    實施例7 抗缺口1抑制抗體對內皮細胞芽生、血管生成及血管化之效應 A.抗缺口1抑制抗體之活體外評估
    抗缺口1抑制抗體對於血管生成之效應係於內皮細胞芽生之活體外模型中檢測，使用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)纖維蛋白膠顆粒試驗(FGBA)(在此處亦稱為HUVEC-FGBA)。改良版之HUVEC-FGBA基本上係根據Nakatsu等人(Microvasc.Res.66(2)：102-112,2003)所述實施，除了以初代人肺腫瘤相關纖維母細胞(LTAF)取代Detroit 551皮膚纖維母細胞。HUVEC芽生在添加纖維母細胞之後10至15天檢測。
    人肺腫瘤組織(樣本87852A1；Asterand,Detroit,MI)係經機械及酶去聚集化。細胞過篩通過40 μm細胞過濾器以獲得單細胞懸浮液。存活細胞在經紅血球溶胞液(Roche,Indianapolis,IN)處理及磁分離去除死細胞(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)後被分離。初代肺腫瘤相關纖維母細胞係經建立及維持於含有20% FBS之RPMI培養基中。
    該含有LTAF之HUVEC-FGBA係經大鼠438、大鼠351或A2抗體處理。亦包括僅培養基(未經處理)及抗VEGF抑制劑AVASTIN(Genentech,So.San Francisco,CA)之對照處理。圖16顯示經大鼠438、大鼠351及A2處理之HUVEC芽生在第10天之CD31-Cy3免疫染色之代表性表螢光影像。大鼠438及大鼠351處理相較於僅培養基(未經處理)之對照顯示HUVEC芽生及血管長度增加。相反地，以抗VEGF抑制劑AVASTIN處理完全防止HUVEC芽生。因此，大鼠438及大鼠351對缺口1傳訊之抑制以和抗VEGF抑制劑諸如AVASTIN不同之方式去除對血管生成之調節。
    另外，表20顯示大鼠438及大鼠351在第6及第12天處理之HUVEC-FGBA中相較於對照抗球蟲抗體增加每顆粒芽生分支點之平均數。然而，大鼠351在第6天對每顆粒分支點平均數之影響低於大鼠438及A2。到了第12天，大鼠438及大鼠351(還有A2)皆誘導每顆粒類似數量之分支點。在血管生成期間，活性缺口1傳訊負向調節內皮尖端細胞之數量，因此調節分支及芽生之量(Hellstrom,M.et al.,Nature 445(7129)：776-780,2007)。
    B.抗缺口1抑制抗體之活體內評估
    抗缺口1抑制抗體之效應進一步在血管生成及血管化之活體內小鼠試驗中檢測。新生鼠視網膜係已知特性之血管生成模型，已被用於研究缺口途徑在此過程中之作用。小鼠視網膜自出生開始有廣泛之血管生成。如同人之視網膜，該血管分布源自視神經並向外擴張以形成血管網，該血管網接著向下芽生以建立次級網路。以基因及藥物操控缺口傳訊已經顯示適當之缺口傳訊係新生視網膜之血管生成所需(Hellstrom,M.et al.,Nature 445(7129)：776-780,2007)。
    懷孕CD-1小鼠被分開單獨飼養，定期監測幼鼠之出生。以大鼠438-mIgG1組而言，幼鼠在出生後第1及3天被投予10 mg/kg之對照抗球蟲抗體、10 mg/kg之大鼠438-mIgG1或10 mg/kg之A2。以大鼠351-mIgG1組而言，幼鼠在出生後第1及3天被投予30 mg/kg之對照抗球蟲抗體、30 mg/kg之大鼠351-mIgG1或30 mg/kg之A2。
    在出生後第5天，幼鼠被安樂死，取出眼睛於2%甲醛中固定隔夜。隔天，將眼睛換到PBS中，分離視網膜。為了染色視網膜，異凝集素B4(Sigma,St.Louis,MO)係利用標示套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)與Alexa Fluor 488共軛，並使用15 mg/ml於PBS中，該PBS含有10%山羊血清、1% Triton X-100、0.1%疊氮鈉、及各0.1 mM之CaCl2、MgCl2及MnCl2。視網膜以含有1% Triton X-100、0.1%疊氮鈉、及各0.1 mM之CaCl2、MgCl2及MnCl2之PBS清洗5次，最後再以含有0.1%疊氮鈉及各0.1 mM之CaCl2、MgCl2及MnCl2之PBS清洗一次。視網膜被切片及以Fluormount-G螢光封片劑(EMS,Hatfield,PA)封片，利用蔡司(Zeiss)LSM510共軛焦顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging,LLC,Thornwood,NY)成像。圖17顯示血管生成之小鼠視網膜模型在經大鼠438-mIG1、大鼠351-mIgG1及A2處理後的異凝集素B4-Alexa488染色之代表性共軛焦圖。抗球蟲抗體及無處理之對照組亦被包括。
    如圖17所示，在大鼠438-mIgG1處理組中之小鼠幼鼠視網膜相較於抗球蟲抗體及無處理對照組中之小鼠幼鼠視網膜具有不同之血管分布。這表示大鼠438-mIgG1抗體干擾活體內之血管生成。特別是，大鼠438-mIgG1處理組之視網膜顯示更廣泛之血管分布，類似之前研究所指出之以基因及藥物操控缺口傳訊後之結果(Hellstrom,M.et al.,Nature 445(7129)：776-780,2007)。這表示以大鼠438-mIgG1抑制缺口1傳訊直接影響小鼠新生視網膜之血管生成。
    另如圖17所示，在大鼠351-mIgG1處理組中之小鼠幼鼠視網膜相較於抗球蟲抗體及無處理對照組中之小鼠幼鼠視網膜具有類似之血管分布。相反地，A2組之視網膜顯示更廣泛之血管分布，類似之前研究所指出之以基因及藥物操控缺口傳訊後之結果(Hellstrom,M.et al.,Nature 445(7129)：776-780,2007)。這顯示相較於A2，大鼠351-mIgG1抗體並不顯著干擾小鼠活體內血管生成，或者大鼠351-mIgG1對小鼠血管分布之可能影響並未在該選定之時間點或該測試之劑量方案下觀察到。 實施例8 抗缺口1抑制抗體對於具有天然及突變缺口1受體之細胞系的影響 A.抗缺口1抑制抗體對於具有天然缺口1受體之人纖維母細胞細胞系CCD1076SK之缺口1活化的影響
    缺口1傳訊係由配體結合活化，該結合誘導胞外缺口1 NRR結構域內之構形改變，藉此暴露金屬蛋白酶及γ分泌酶切割位點。蛋白水解導致轉錄活化子缺口1胞內域(缺口1ICD)自細胞膜釋放。缺口1活化及缺口1ICD釋放係藉由西方墨點試驗分析產自人纖維母細胞細胞系CCD1076SK之蛋白質萃取物加以檢測，該細胞被接種於重組人DLL4配體上，並以濃度漸增之大鼠438、大鼠351或A2抗體、及對照抗球蟲抗體處理24小時。經釋放之始於纈胺酸殘基之缺口1ICD分子係利用D3B8抗體(抗缺口1ICD)檢測(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)。
    為了活化缺口1傳訊，該CCD1076SK皮膚纖維母細胞係於DLL4配體存在時培養。六孔孔盤係經在含有CaCl2及MgCl2之1X DPBS中之2 μg/ml之重組人DLL4(R&D Systems,Minneapolis,MN)包覆。在含有10%FBS之DMEM培養基中之2x10E6 CCD1076SK皮膚纖維母細胞被添加至該經重組人DLL4包覆之孔槽中，該槽中有0、0.001、0.01、0.1、1及10 μg/ml之大鼠438、大鼠351及A2抗體、及對照抗球蟲抗體之存在。細胞係於37℃之5% CO2中與該些抗體培養24小時。細胞被溶解於1% NP40、0.5%去氧膽酸鈉、5 mM EDTA、0.25 M NaCl、0.025 M Tris-HCl pH 7.5中，且含有Complete Mini蛋白酶抑制劑混合液(Roche)及0.4 mM PMSF。萃取物藉由7.5%聚丙醯胺膠體之SDS-PAGE解出，並利用iBlot膠體轉移系統(Invitrogen)被轉印至硝化纖維素紙。該經釋放之始於纈胺酸殘基之缺口1ICD分子係利用抗缺口1ICD及作為裝載對照之抗β肌動蛋白檢測，使用標準西方墨點程序。光密度分析係於經BioRad GS-800校準型光密度儀掃描之底片上實施，並利用Quantity One version 4.6.9軟體(BioRad)分析。缺口1ICD之量係經各樣本中之β肌動蛋白對照正常化，接著與未經處理之對照比較。
    如圖18所示，大鼠438力價以劑量依賴性方式有效地抑制缺口1活化，如該經檢測之經釋放之缺口1ICD之量顯示。另如圖18及表21所示，高達10 μg/mL之大鼠351力價顯示相較於A2對天然缺口1受體之缺口1活化之較低抑制，如該經檢測之經釋放之缺口1ICD之量顯示。在所有濃度中，特別是從0.1 μg/mL開始，大鼠351顯示相較於A2較高量之經釋放之缺口1ICD。
    B.抗缺口1抑制抗體對於具有突變缺口1受體之T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)細胞系之缺口1活化的影響
    組成性缺口1活化及缺口1胞內結構域(缺口1ICD)之釋放係於T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)病患及T-ALL細胞系之亞群中報告，該亞群在缺口1受體之NRR結構域內具有突變(Weng et al.,Science 306：269-271,2004)。這些突變可被分成3個主要類型。第1型突變係在HD1中之單一胺基酸取代及小型符合讀框順序地刪除或插入。第2型突變係在HD2之遠端區域中之較長插入，該插入重置該S2金屬蛋白酶切割位點至自動抑制NRR結構域以外。第3型突變亦稱為近膜延伸(JME)突變，該突變使NRR遠離細胞膜。
    經測試之具有缺口1受體第1型突變之T-ALL細胞系包括在胺基酸1575處之白胺酸突變成脯胺酸(L1575P)之HPB-ALL細胞、在胺基酸1594處之白胺酸突變成脯胺酸(L1594P)之ALL-SIL細胞、在胺基酸1601處之白胺酸突變成脯胺酸(L1601P)之MOLT-4細胞、及具有在胺基酸位置1594之白胺酸突變成脯胺酸和在胺基酸位置1610之天冬胺酸突變成纈胺酸(L1594P/D1610V)之複合第1型突變之DND-41細胞。CCRF-CEM細胞系獲得第2型突變，在位置1595處具有12個胺基酸插入。Jurkat細胞系獲得第3型JEM突變，在位置1740處具有17個胺基酸插入。
    缺口1活化及缺口1ICD釋放係藉由西方墨點試驗分析產自T-ALL細胞系之蛋白質萃取物加以檢測，該細胞系經濃度漸增之大鼠438-mIgG1、人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠351-mIgG1或A2抗體、及對照抗球蟲抗體處理。經釋放之始於纈胺酸殘基之缺口1ICD分子利用D3B8抗體(抗缺口1ICD)特異性檢測。
    T-ALL細胞系HPB-ALL、ALL-SIL、CCRF-CEM、MOLT-4、DND-41及Jurkat細胞被用來取代如上述之CCD1076SK纖維母細胞。由於T-ALL細胞具有組成性釋放之缺口1ICD，因此不需要使用外源性DLL4配體。2x10E6 T-ALL細胞之懸浮培養液與在含有10% FBS、青/鏈黴素/麩醯胺酸之RPMI 1640培養基中之0、0.001、0.01、0.1、1及10 μg/ml之大鼠438-mIgG1、人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠351-mIgG1或A2抗體、及對照抗球蟲抗體混合。細胞係於37℃之5% CO2中與該些抗體培養24小時。離心收集細胞，吸取移除培養基。細胞團塊被溶解於1% NP40、0.5%去氧膽酸鈉、5 mM EDTA、0.25 M NaCl、0.025 M Tris-HCl pH 7.5中，且含有Complete Mini蛋白酶抑制劑混合液(Roche)。萃取物藉由7.5%聚丙醯胺膠體之SDS-PAGE解出，並利用iBlot膠體轉移系統(Invitrogen)被轉印至硝化纖維素紙。該經釋放之始於纈胺酸殘基之缺口1ICD分子係利用抗缺口1ICD及作為裝載對照之抗β肌動蛋白檢測，使用標準西方墨點程序。光密度分析係於經BioRad GS-800校準型光密度儀掃描之底片上實施，並利用Quantity One version 4.6.9軟體(BioRad)分析。缺口1ICD之量係經各樣本中之β肌動蛋白正常化，接著與未經處理之對照比較。
    如圖19所示，經漸增濃度之大鼠438-mIgG1及人化438 VH1.1/VL1.8處理之HBP-ALL細胞顯著抑制組成性缺口1活化，如該經檢測之經釋放之缺口1ICD之量顯示。因此，在位置1575之白胺酸突變成脯胺酸不影響大鼠438-mIgG1及人化438 VH1.1/VL1.8抗體抑制缺口1活化之能力。此與表14之結果一致，該表顯示大鼠438抗體不與野生型NRR-抗體共結晶結構中位置1575之胺基酸交互作用。
    如圖20及表22所示，以漸增濃度之大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1及A2處理T-ALL細胞系HPB-ALL、ALL-SIL、CCRF-CEM、MOLT-4及DND-41細胞以劑量依賴方式抑制缺口1活化，如西方墨點及光密度分析中減少偵測到該經釋放之缺口1ICD所示。相反地，以漸增濃度之大鼠351-mIgG1及A2處理Jurkat細胞無法抑制缺口1活化，如西方墨點分析中檢測到該經釋放之缺口1ICD所示。如預期般，該對照抗球蟲抗體顯示在T-ALL細胞系之任一者中對於經釋放之缺口1ICD之量無影響。
    大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1及A2抗體在具有第1型(L1575P之HPB-ALL細胞、L1594P之ALL-SIL細胞、L1601P之MOLT-4細胞、及複合第1型突變L1594P/D1610V之DND-41細胞)及第2型(在位置1595具有12個胺基酸插入之CCRF-CEM細胞系)NRR突變之某些T-ALL細胞系中類似地抑制缺口1活化及釋放缺口1ICD，且大鼠351-mIgG1及A2無法在具有第3型JEM突變之Jurkat細胞中抑制缺口1受體之切割及釋放缺口1ICD。另外，大鼠351-mlgG1顯示對突變缺口1受體較高之缺口1活化抑制(如圖20及表22)所示，相較於大鼠351對天然缺口1受體之缺口1活化抑制(如圖18及表21)所示。
    C.抗缺口1抑制抗體對於具有突變缺口1受體之T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)細胞系之存活性的影響
    抗缺口1抗體對於HBP-ALL細胞之影響進一步利用MTS細胞存活指標(Promega,Madison,WI)評估，以測定處理後存活細胞之百分比。該MTS試劑會被具有代謝活性之存活細胞轉換成可在光密度490奈米(O.D.490 nm)下被測量之產物，但不會被死細胞轉換。於含有10% FBS、青/鏈黴素/麩醯胺酸之RPMI 1640培養基中的HBP-ALL細胞(1x10E4細胞/孔)係與0、0.47、1.88、7.5及30 μg/ml之人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1、A2抗體、及對照抗球蟲抗體一起培養7天，接著根據廠商說明以MTS試劑檢測。
    表23顯示HPB-ALL細胞以漸增濃度之大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1、A2抗體及對照抗球蟲抗體的抗缺口1抑制抗體處理之MTS存活性試驗。結果顯示，經最高達30μg/ml之漸增濃度之大鼠438-mIgG1、351-mIgG1及A2處理之HBP-ALL細胞相較於對照抗球蟲處理在O.D.490 nm顯示較低量之該經轉換之MTS試劑。此表示較少細胞存在於大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1及A2處理細胞中，因為細胞死亡增加及/或增生減少。
    類似結果在使用人化438 VH1.1/VL1.8之情形中觀察到(如表24所示)，該表說明HPB-ALL細胞以漸增濃度之人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠438-mIgG1、及對照抗球蟲抗體的抗缺口1抑制抗體處理之MTS試驗。因此，除了抑制缺口1活化之外，人化438 VH1.1/VL1.8抗體亦抑制在缺口1之NRR結構域具有突變之癌細胞(此為T-ALL病患之常見特徵)的生長。
    為了瞭解突變大鼠351抗體之活體外活性，HPB-ALL細胞係經漸增濃度之大鼠351-mIgG1、大鼠351(R58Y)-mIgG1、大鼠351(R58Y/V60A)-mIgG1、438人化VH1.1/VL1.8、A2抗體、或對照抗球蟲抗體之處理。表25顯示抗缺口1抑制抗體處理之MTS試驗及彼等導致之IC50值。大鼠351(R58Y)-mIgG1及大鼠351(R58Y/V60A)-mIgG1抗體二者抑制HPB-ALL生長，以彼等之IC50值來說，該抑制方式較類似人化438 VH1.1/VL1.8而不像野生型大鼠351-mIgG1抗體。因此，在大鼠351-mIgG1中之Arg58殘基導致彼對於具有突變NRR之缺口1受體的有效抑制活性。
    實施例9 抗缺口1抑制抗體對於人腫瘤異種移植之活體內生長之影響 A.缺口1及Jagged1之共免疫組織化學
    抗缺口1抑制抗體之效應係於臨床前模型中測試，該模型中之缺口1同時表現於異種移植之腫瘤及宿主基質細胞二者以最大化彼等之可能效應。為了識別表現缺口1及彼之配體之一的Jagged1之臨床前模型，使用抗缺口1及抗Jagged1抗體之免疫組織化學係於37622A1非小細胞肺癌(NSCLC)病患衍生性異種移植(PDX)(以下稱為「37622A1 NSCLC PDX」)上實施。源自37622A1 NSCLC PDX之組織片段係利用標準組織學程序經福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)。切出5微米之FFPE切片，進行脫蠟及蒸餾水水合。在壓力鍋中pH 6.0檸檬酸鹽緩衝液中修復抗原。內源性過氧化酶係利用0.3% H2O2封閉15分鐘。切片與DAKO蛋白質封片液培養20分鐘。內源性生物素係由抗生物素蛋白/生物素阻斷套組(Vector)阻斷。1：50稀釋之兔抗缺口1(ab52627；Abcam)在室溫中被施用於切片上1小時。抗兔IgG-生物素(JacksonImmuno)在室溫中被施用於切片上30分鐘。鏈黴抗生物素蛋白-HRP在室溫中被添加至切片上30分鐘。DAB被用來顯色5分鐘。切片於pH 6.0檸檬酸鹽緩衝液中加熱至98℃ 10分鐘，以破壞在第一反應中抗缺口1一級抗體及抗兔IgG二級抗體之結合。切片係以DAKO蛋白質封片液封片20分鐘，並與1：100稀釋之兔抗Jagged 1抗體(Santa Cruz)在室溫下培養2小時。抗兔IgG-HRP聚合物(DAKO)在室溫中施用30分鐘。ImmPACT VIP受質被用來顯色7分鐘。切片經Mayer’s蘇木精快速對比染色、脫水、清潔及蓋上蓋玻片。
    如圖21所示，37622A1 NSCLC PDX在群集之腫瘤細胞內(以實線界定)異質性表現人缺口1受體(虛線左側)及人Jagged1配體(虛線右側)。細胞核缺口1ICD(箭頭)亦在人缺口1及人Jagged1腫瘤細胞之交界處檢測到，顯示活性缺口1傳訊。在小鼠基質內，小鼠缺口1亦在PDX相關血管分布中檢測到，與先前缺口1傳訊調節小鼠新生視網膜中之血管生成的發現一致。該缺口1及Jagged1於該37622A1 NSCLC PDX中之表現模式顯示其為檢測抗缺口1抗體之活體內效應之相關模型。
    在NSCLC中，K-ras係經常發生突變之致癌基因，該致癌基因增進腫瘤之生長。因此，源自37622A1 NSCLC PDX之K-ras基因係經定序以測定其包含野生型或突變K-ras。基因組DNA係利用PrepGEM套組根據廠商說明(ZyGEM,Solana Beach,CA)自37622A1 NSCLC PDX之片段分離。K-ras DNA序列使用前置及反置引子，利用KOD聚合酶(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)擴增。PCR循環條件：1週期於75℃ 15分鐘，1週期於95℃ 5分鐘，1週期於96℃ 1分鐘，及35週期於96℃ 15秒、60℃ 15秒及72℃ 40秒，及1週期於72℃ 1分鐘20秒。經擴增之496對鹼基對之PCR產物係利用QIAquick PCR純化套組(Qiagen,Valencia,CA)純化，及利用BigDye Terminator v1.1 Cycle定序套組(ABI,Foster City,CA)根據廠商說明實施DNA定序。
    如圖22所示，DNA序列分析顯示該37622A1 NSCLC PDX在人K-ras基因中之胺基酸13處具有甘胺酸變纈胺酸(由DNA序列GTT編碼)之突變(G13V)。 B. NSCLC異種移植之活體內生長抑制試驗
    於免疫不全小鼠中檢測抗缺口1抑制抗體對於人腫瘤異種移植之活體內生長之效應，該異種移植係自根據適當同意程序(Asterand公司)獲得之新鮮切除之NSCLC腫瘤之片段建立。該87393A1 NSCLC病患衍生性異種移植及37622A NSCLC病患衍生性異種移植(以下分別稱為「87393A1 NSCLC PDX」及「37622A1 NSCLC PDX」)分別於NOD-SCID及裸鼠(Nu/Nu)母鼠中以動物至動物之片段被活體內繼代。
    當腫瘤到達200至400 mm3之體積時，它們被分期以確保在不同處理組中之腫瘤大小的一致性，然後才投予抗缺口1及對照抗球蟲抗體。該37622A1 NSCLC PDX模型係經i.p.投予10 mg/kg之大鼠438-mIgG1、A2、及對照抗球蟲抗體每周一次共3周。該87393A1 NSCLC PDX模型係經i.p.投予20 mg/kg之大鼠351-mIgG1、及對照抗球蟲抗體每周二次共4周。每周至少測量一次腫瘤，彼等之體積係以下式計算：腫瘤體積(mm3)=0.5×(腫瘤寬度2)(腫瘤長度)。各處理組有介於8至11之動物，平均腫瘤體積(±SEM)係經計算並與對照處理組比較。
    表26顯示大鼠438-mIgG1及A2抗體於具有K-ras G13V突變之37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植中相較於對照抗球蟲抗體之療效。大鼠438-mIgG1對37622A1 PDX之生長抑制顯示具有經活化之缺口1及/或K-ras致癌基因突變之NSCLC可能對缺口1途徑抑制劑敏感。
    表27顯示大鼠351-mIgG1於87393A1 NSCLC PDX中相較於對照抗球蟲抗體之療效。以大鼠351-mIgG1處理相較於對照抗球蟲處理腫瘤於第28天導致29%之腫瘤生長抑制。
    為了證實缺口1活化受到抑制，使用D3B8抗體(抗缺口1ICD)之西方墨點分析係在試驗結束時於產自異種移植之蛋白萃取物上實施。在試驗結束時，收集經大鼠438-mIgG1、A2、及對照抗球蟲處理之37622A1 NSCLC PDX模型的異種移植，及經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲處理之87393A1 NSCLC PDX模型的異種移植。腫瘤組織被溶解於1% NP40、0.5%去氧膽酸鈉、5 mM EDTA、0.25 M NaCl、0.025 M Tris-HCl pH 7.5中，且含有Complete Mini蛋白酶抑制劑混合液(Roche)。萃取物藉由7.5%聚丙醯胺膠體之SDS-PAGE解出，並利用iBlot膠體轉移系統(Invitrogen)被轉印至硝化纖維素紙。使用標準西方墨點分析，經釋放之始於纈胺酸殘基之缺口1ICD分子係以D3B8抗體(抗缺口1ICD)檢測，缺口1 C端結構域之總量係以D1E11(抗缺口1)(Cell Signaling Technologies公司)檢測。β肌動蛋白被用來作為裝載對照。
    圖23顯示產自經大鼠438-mIgG1及A2處理之37622A1 NSCLC PDX的蛋白質萃取物之西方墨點分析。經釋放之缺口1ICD之檢測係於經對照抗球蟲處理之腫瘤中觀察到，但未見於經大鼠438-mIgG1處理之腫瘤中，表示對缺口1活化之抑制。圖24顯示產自經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理之87393A1 NSCLC PDX的蛋白質萃取物之西方墨點分析。經釋放之缺口1ICD之檢測係於經對照抗球蟲處理之腫瘤中觀察到，但未見於經大鼠351-mIgG1處理之腫瘤中，表示對缺口1活化之抑制。
    該原始87393A1 NSCLC PDX樣本之捐贈者臨床資料顯示，該病患之腫瘤係肺的侵入性分化不良之鱗狀細胞癌。內披蛋白係肺腫瘤鱗狀細胞分化之標記(Said,J.W.,et.al.,Laboratory Investigation,1983,volume 49,563-568)。為了測定缺口1活化之抑制是否對87393A1 NSCLC PDX腫瘤細胞分化有所影響，內披蛋白表現係利用免疫組織化學及西方墨點分析測量。圖25及26分別顯示內披蛋白於大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲處理腫瘤中之免疫組織化學及西方墨點分析。在87393A1 NSCLC PDX中抑制缺口1之活化導致增加內披蛋白之表現量，如免疫組織化學及西方墨點分析所示。因此，除了減少腫瘤體積之外，抗缺口1處理亦增加腫瘤細胞之分化。
    為了測定光是缺口1活化之抑制是否能影響體重，小鼠在活體內療效試驗期間被秤量體重。表28顯示在87393A1 NSCLC PDX中，大鼠351-mIgG及對照抗球蟲抗體處理組之平均小鼠體重(減腫瘤重量)在試驗期間並無顯著不同。
    C. HPB-ALL異種移植之活體內生長抑制試驗
    和上述37622A1 NSCLC PDX及87393A1 NSCLC PDX所進行之類似的活體內試驗係利用突變缺口1 HPB-ALL細胞系實施。為了產製異種移植，母裸鼠(Nu/Nu)係經8x10E6 HPB-ALL細胞於50%基質膠(BD Biosciences公司)之皮下植入。當腫瘤到達200至400 mm3之體積時，腫瘤被分期以確保在不同處理組中之腫瘤質量的一致性，然後才投予抗缺口1及對照D16A抗體。該HPB-ALL模型係經s.c.投予20 mg/kg之大鼠438-mIgG1、351-mIgG1、A2、或D16A抗體每周二次共2周。每周至少測量一次腫瘤，彼等之體積係以下式計算：腫瘤體積(mm3)=0.5×(腫瘤寬度2)(腫瘤長度)。各處理組有介於8至11之動物，平均腫瘤質量(±SEM)係經計算並與對照處理組比較。
    表29顯示大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1及A2抗體對於具有L1575P突變之缺口1 NRR之HPB-ALL異種移植之療效。該資料顯示大鼠438-mIgG1之處理及大鼠351-mIgG1之處理相較於對照D16A抗體皆抑制HPB-ALL細胞之活體內生長，因此減緩腫瘤生長。
    D. Calu-6 NSCLC異種移植之活體內生長抑制試驗
    如上述於活體內試驗中以HPB-ALL細胞實施之類似試驗係利用Calu-6 NSCLC細胞系實施。Calu-6異種移植首先係於母裸鼠(Nu/Nu)中利用2x10E6活體外培養細胞於50%基質膠(BD Biosciences公司)建立，接著於活體內以動物至動物之腫瘤片段被連續繼代。當腫瘤到達200至400 mm3之體積時，腫瘤被分期以確保在不同處理組中之腫瘤大小的一致性，然後才投予抗缺口1及對照抗體。該Calu-6模型係經i.p.投予3、10及30 mg/kg之大鼠438-mIgG1或A2，或10 mg/kg之對照抗球蟲抗體每周二次共2周。每周至少測量一次腫瘤，彼等之體積係以下式計算：體積(mm3)=0.5×(腫瘤寬度2)(腫瘤長度)。各處理組有介於8至11之動物，平均腫瘤體積(±SEM)係經計算並與對照處理組比較。
    之所以選擇Calu-6模型是因為該模型以前顯示對於缺口途徑抑制劑諸如抗DLL4(Ridgeway et al.,Nature 444：1083-1087,2006)及A2抗體有反應。表30顯示大鼠438-mIgG1及A2於Calu-6肺癌模型中之療效。以3 mg/kg、10 mg/kg及30 mg/kg之大鼠438-mIgG1處理導致劑量依賴性之腫瘤生長減少。然而，有效(>50%)之Calu-6異種移植生長減少僅發生在30 mg/kg劑量，該劑量為抑制37622A1 PDX生長至相同程度所需劑量之3倍。
    為了測定光是抑制缺口1之傳訊是否能影響體重，小鼠在活體內療效試驗期間被秤量體重。表31顯示大鼠438-mIgG1、A2及對照抗球蟲處理組之平均小鼠體重(減腫瘤重量)在試驗期間並無顯著不同。
    E.乳癌異種移植之活體內生長抑制試驗
    人化438 VH1.1/VL1.8之療效係於三重陰性乳癌異種移植模型(Sum149及MDA-MB-231)之活體內生長檢測。無胸腺母鼠(Nu/Nu,6至8週齡)係得自查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)，根據國際實驗動物管理評鑑及認證協會之規定於無特定病原之條件下飼養。動物可自由採食無菌之鼠飼料及飲水。
    用於植入無胸腺小鼠之細胞係經採集並利用450Xg離心5至10分鐘以形成團塊。該細胞團塊經沖洗一次及重懸於無菌不含血清之培養基中。腫瘤細胞添加50%基質膠(BD Biosciences公司)以利於經選定之腫瘤細胞作為異種移植之腫瘤攝取及生長。細胞(2-3×106於100 μL中)係經皮下植入至小鼠後側腹區域，允許腫瘤生長至預定大小然後才投予各實驗之化合物。
    以抗腫瘤療效而言，負荷大小150至300 mm3之腫瘤的動物被隨機分配至接受對照抗體(26H6)或人化438 VH1.1/VL1.8之組別，這些動物經s.c.注射每周投藥。多西紫杉醇(docetaxel)係經i.p.注射每周投藥。每2至3天測量一次腫瘤。腫瘤體積(mm3)係以Vernier卡尺測量，並利用下式計算：長度(mm)×寬度(mm)×寬度(mm)×0.52，如表32及33所示。

    藥物處理相較於載劑處理小鼠之抑制百分比(%)之值係於試驗最後一天測量，並以100-{1-[(處理最後一天-處理第1天)/(對照最後一天-對照第1天)]}計算。在所有腫瘤生長抑制試驗中，每劑量組使用8至10隻小鼠。學生t檢定被用於決定P值。表34顯示人化438 VH1.1/VL1.8於三重陰性乳癌異種移植模型中之療效。
    實施例10 抗缺口1抑制抗體對於小腸細胞分化及增生之影響
    藥理及基因抑制缺口傳訊使在小腸隱窩內之增生性祖細胞轉換成分泌性杯狀細胞(van Es et al.,Nature 435：959-963,2005)。抗缺口1抑制抗體對於小鼠小腸細胞之增生及分化的影響係於實施例9之Calu-6及87393A1 NSCLC PDX療效實驗所收集之組織上檢測。使用亞爾襄藍染色黏液素(即分泌性杯狀細胞)及抗Ki67用於增生之免疫組織化學係於小腸樣本上實施。
    小鼠小腸係採集自Calu-6及87393A1 NSCLC PDX療效試驗，該小腸經縱向修剪、福馬林固定及保存於70% ETOH。該組織接著以石蠟包埋。根據廠商說明，用亞爾襄藍染色黏液物質。使用抗Ki67抗體(SP6，Abcam公司，Cambridge,MA)之免疫組織化學係於Dako自動染色儀(Dako,Carpinteria,CA)上實施，以根據廠商說明顯示細胞增生。 1.影像捕捉
    經染色之組織切片利用20X物鏡設定在Nanozoomer切片掃描儀(Hamamatsu,Bridgewater,NJ)上掃描。影像經掃描及儲存為ndp檔案格式。虛擬影像係於Aperio Image Scope Software影像瀏覽軟體(Aperio Technologies,Vista,CA)上開啟。來自小腸腸腔對側之二個影像在10X虛擬放大被捕捉，並存為Tiff影像。
    圖27顯示利用亞爾襄藍染色來自Calu-6療效試驗中之小鼠小腸的迴腸部分之分泌性杯狀細胞之組織化學識別，該小鼠係經10 mg/kg之大鼠438-mIgG1、A2或對照抗球蟲抗體之處理。顯示小腸絨毛及隱窩之代表性影像。杯狀細胞係以箭頭標示，為了簡單起見，在各影像中僅指出1個細胞以為代表。雖然抗缺口1抗體在試驗期間不造成體重減輕，但以大鼠438-mIgG1或A2處理誘導分泌性杯狀細胞之分化，因為在絨毛及隱窩中之亞爾襄藍染色增加。因此光是抑制缺口1之傳訊會增加杯狀細胞之分化，然而不會到達顯著影響體重之程度。 2.影像分析
    在Image Pro-Plus軟體(Media Cybernetics,Bethesda,MD)上開啟虛擬影像。手動描繪出受到關注區域(AOI)之輪廓，該區域包括該小腸組織(隱窩及絨毛)，但排除平滑肌、人工物、摺疊及殘渣。產生閥值以識別亞爾襄藍染色區域及組織區域。該閥值被套用至該AOI，範圍統計學被輸出至Excel工作表。在Excel中，自二個收集之染色比計算各動物之平均亞爾襄藍染色之比以提供單一經計算之每隻動物之亞爾襄藍染色比。計算各組之平均亞爾襄藍染色比及標準差。統計學係利用JMP統計軟體(JMP,Cary,NC)實施。
    表35顯示在Calu-6療效試驗中經大鼠438-mIgG1、A2、及對照抗球蟲抗體處理之小鼠小腸的亞爾襄藍染色比之影像定量。相較於10 mg/kg之抗球蟲對照，投予10 mg/kg及30 mg/kg之大鼠438-mIgG1的亞爾襄藍染色比顯著增加。亞爾襄藍染色之定量影像分析證實杯狀細胞在相較於圖27所示區域之更大的迴腸區域有增加之分化。
    各處理組之平均亞爾襄藍染色比之成對比較統計分析係顯示於表36。各比值之成對比較係利用學生t檢定測定。陽性值顯示顯著不同之平均值之對。和A2不同的是，以3 mg/kg投予之大鼠438-mIgG1相較於對照抗球蟲抗體不誘導亞爾襄藍染色比之顯著增加。另外，以10 mg/kg投予之A2相較於以10 mg/kg投予之大鼠438-mIgG1誘導顯著增加之亞爾襄藍染色比，顯示大鼠438-mIgG1比起A2造成較少小腸細胞之細胞分化。
    圖28顯示來自Calu-6療效試驗中之小鼠小腸隱窩的抗Ki67免疫組織化學，該小鼠係經10 mg/kg之大鼠438-mIgG1、A2或對照抗球蟲抗體處理。顯示經Ki67染色之小腸隱窩的代表性影像。經大鼠438-mIgG1處理動物之隱窩底部顯示Ki67染色減少，但經對照抗球蟲處理之動物則否。失去Ki67染色之增生性隱窩細胞係與在亞爾襄藍染色中觀察到之轉換成有絲分裂後之杯狀細胞一致。
    表37顯示在87393A1 NSCLC PDX療效試驗中經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理之小鼠小腸的亞爾襄藍染色比之影像定量。相較於抗球蟲對照，經大鼠351-mIgG1處理小鼠之亞爾襄藍染色比並無顯著差異(p=0.22)。該亞爾襄藍染色之定量影像分析顯示大鼠351-mIgG1不像其他缺口途徑抑制劑般誘導杯狀細胞之增生。因此，大鼠351-mIgG1對缺口1傳訊之抑制不會增加杯狀細胞分化。
    圖29及表38顯示來自87393A1 NSCLC PDX療效試驗之經大鼠351-mIgG1或對照抗球蟲抗體處理之小鼠小腸隱窩上的抗Ki67免疫組織化學及Ki67染色比之定量。圖29顯示經Ki67染色之小腸隱窩的代表性影像，該圖顯示經大鼠351-mIgG1處理之動物的隱窩底部之Ki67染色減少，但經對照抗球蟲處理之動物則否。
    與此觀察一致的是，表38顯示經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理之小鼠小腸的Ki67染色比之影像定量。該資料顯示大鼠351-mIgG1相較於對照抗球蟲抗體之處理具有小量但具統計顯著性(p=0.023)之Ki67染色比降低。Ki67染色比之定量分析顯示在隱窩底部之細胞增生減少，如Ki67染色在相較於圖29之上圖所示之區域更大之迴腸區域顯示相對量之減少。因此，大鼠351-mIgG1對缺口1傳訊之抑制減少增生。
    實施例11 抗缺口1抑制抗體之藥物動力學及藥物藥效學 1.碘化程序
    碘化係利用IODO-BEADS方法根據廠商說明(Pierce,Rockford,IL)實施。簡言之，每2 mCi之125-碘(珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司)使用約200 μg之測試物品，在環境溫度中與2 IODO-BEADS及約200 μL之PBS培養15至25分鐘。藉由過濾(密里博(Millipore)公司之Centricon-10，Billerica,MA)分開反應混合物與IODO-BEADS。 2.投予溶液之製備及特徵
    以大鼠438-mIgG1而言，投予溶液係藉由混合未經標示之測試物品大鼠438-mIgG1、微量之經125I-標示之測試物品及調製緩衝液(PBS)，使最終蛋白質濃度為2 mg/mL以令投予至小鼠之投予體積為10 mL/kg加以製備。以大鼠351-mIgG1而言，三種投予溶液係藉由混合未經標示之測試物品大鼠351-mIgG1、微量之經125I-標示之測試物品及調製緩衝液(PBS)，使最終蛋白質濃度為2、0.5及2.4 mg/mL加以製備，以令投予至第一組(5 mg/kg i.v.)、第二組(5 mg/kg i.p.)及第三組(30 mg/kg i.p.)之小鼠的投予體積分別為2.5、10及12.5 mL/kg。
    在投予溶液中由游離碘(「%游離碘」)所代表之放射性組分係利用三氯乙酸(TCA)沉澱測定。投予溶液之等分(5 μL)係與小鼠血清(45 μL)混合，並計數(三次)總放射性(Model 1480 WIZARDTM,Wallac Inc.,Gaithersburg,MD或Model 2470 Perkin Elmer,Waltham MA)。添加TCA(50 μL之20%保存液)至該樣本。樣本以大約3000 g離心10分鐘。計數50 μL等分之形成上清液的可溶性每分鐘計數次數(cpm)。投予溶液中之游離碘組分係利用下式計算：[2 ＊平均可溶性洗脫液cpm/平均總洗脫液cpm ＊ 100%]。該投予溶液之特定活性(μCi/mg)係由下式計算：[平均總cpm-2＊平均可溶性cpm]/[投予溶液濃度(mg/mL)＊投予溶液體積(mL)＊2,200,000 cpm/μCi]。該投予溶液之純度亦利用SDS-PAGE定性分析，且證實在非還原條件下為主要單鍵及在還原條件下為雙鍵。 3.測定血清及組織中之放射性當量濃度
    血清樣本(50 μL，重複二次)中之總放射性係由γ計數測定。添加相等體積之20% TCA至各血清等分，樣本以約12000 rpm離心10分鐘。在50 μL上清液等分中之TCA可溶性放射性係由γ計數測定。給定樣本中之TCA可沉澱性放射性(cpm)(總cpm-2＊TCA可溶性cpm)、該投予溶液之特定活性(每mg蛋白質之TCA可沉澱性cpm)、以及測量樣本(tS)及投藥溶液(tD)之日期被用於計算在給定樣本中之測試物品濃度，使用下式：[平均TCA可沉澱性cpm/EXP(-0.693/60.2＊(tS-td))]/[特定活性(cpm/mg)＊樣本體積(mL)]。
    經125I標示之測試物品的放射性當量組織濃度之定量(μg eq./g)係根據組織中之總放射性及該投予溶液在校正125I之半衰期後之特定活性，利用下式：[樣本cpm/EXP(-0.693/60.2＊(tS-tD))]/[特定活性(cpm/mg)＊樣本重量(mg)]。組織樣本之TCA沉澱未實施。在給定時間點之組織樣本的組織對血清濃度比(T/S)係利用組織中之放射性當量濃度(μg eq./g)對血清中之該濃度(μg eq./mL)之比計算。 4.藥物動力學計算
    藥物動力學之計算係根據小鼠之平均血清或組織濃度。藥物動力學軟體套組WinNonlin(5.1版)(Pharsight公司)之非房室分析模型(分別在IV及IP投予之後用於分析血清資料之模型201及200)被使用。在血清濃度與時間曲線下之面積(AUC)係利用線性梯形法計算。表觀終末期之斜率係利用至少3個資料點藉由對數線性回歸預估，終末速率常數(λ)係自該斜率衍生。AUC0-∞係經預估為AUC0-t(其中t為最後可測量濃度之時間)和Ct/λ之總和。該表觀終末半衰期(t½)係經計算為0.693/λ。
    表39顯示非荷瘤裸鼠對於大鼠438-mIgG1抗體之血清及組織暴露量，該些值係在5 mg/kg i.p.單次注射經125碘標示之大鼠438-mIgG1抗體後之所示時間點測量。在所有檢測之時間點中最高之放射性當量(RE)濃度及暴露量(AUC0-INF)見於血清，次之為肝、皮膚、腎、大腸、小腸、肺及眼睛。組織中之放射性隨時間降低，如表39所示。雖然缺口1傳訊於小鼠消化道中之表現係已知且具有重要功能，但大鼠438-mIgG1並不會優先累積在大腸或小腸相較於其他測試組織。
    組織對血清濃度之比係經計算，大鼠438-mIgG1之單次5 mg/kg i.p.劑量至裸鼠後之平均組織/血清濃度比係於表40顯示。該組織對血清濃度之比在所檢測之時間點維持相對穩定，表示在血清與組織間達到平衡。大鼠438-mIgG1之血清濃度係高於組織濃度，因此T/S比值為低(通常<1)且在mIgG1之常見範圍內。
    在投予經125I標示之大鼠438-mIgG1之後，Cmax係經計算為16.4 μg eq./mL，在3小時達到Tmax。排泄t1/2為58小時，暴露量(AUC0-∞)為788 μg eq.＊ hr/mL，如表41所示。大鼠438-mIgG1在單次5 mg/kg i.p.劑量後之半衰期相當短(約2.4天)。
    大鼠351-mIgG1之血清暴露量係在單次5 mg/kg i.v、5 mg/kg i.p.或30 mg/kg i.p.注射經125I標示之大鼠351-mIgG1抗體至非荷瘤裸鼠之後測量。該觀察到之血清濃度值被用於計算多種藥物動力學參數，如表42及表43所示。
    表42顯示以i.v.投予5 mg/kg之經125I標示之大鼠351-mIgG1至母裸鼠後之藥物動力學參數。大鼠351-mIgG1之排泄t1/2及系統廓清率分別為約3天(70.2小時)及1.74 mL/hr/kg。穩定狀態之分布體積(Vdss)為177 mL/kg。暴露量(AUC0-INF)為2871 μg eq.hr/mL。
    表43顯示以i.p投予5及30 mg/kg之經125I標示之大鼠351-mIgG1至母裸鼠後之藥物動力學參數。二個劑量組之Cmax分別為30及151 μg eq./mL，二組之Tmax皆在6小時達到。在5及30 mg/kg之後的排泄t1/2分別93及163小時(約4至7天)，暴露量(AUC0-INF)分別為2754及24080 μg eq.＊hr/mL。I.p.及i.v.投予之間的經劑量正常化之AUC比(F)係約1.4，表示小鼠在i.p.投予30 mg/kg後吸收完全。
    大鼠351-mIgG1在非荷瘤裸鼠之血清及組織暴露量係於單次5及30 mg/kg i.p.注射經125I標示之大鼠351-mIgG1之後測量。以5 mg/kg i.p.劑量而言，該最高之放射性當量(RE)濃度及暴露量(AUC0-INF)係見於所有檢測時間點之血清，次之為肝臟、脾臟、皮膚、腎臟、小腸、大腸、肺臟及眼睛，如表44所示。以30 mg/kg i.p.劑量而言，該最高之放射性當量(RE)濃度及暴露量(AUC0-INF)係見於所有檢測時間點之血清，次之為肝臟、皮膚、脾臟、小腸、肺臟、腎臟、眼睛及大腸，如表45所示。該資料顯示5 mg/kg及30 mg/kg i.p.劑量之大鼠351-mIgG1並不會優先累積在大腸或小腸相較於其他測試組織。

    圖1顯示具有Avi及His標籤之重組、經S1切割、異二聚體之缺口1 NRR蛋白質免疫原之示意圖。
    圖2顯示用於表位定位抗缺口1抗體大鼠351-mIgG1、大鼠438-mIgG1及A2之重組人缺口1 NRR及缺口3 NRR結構域交換嵌合性建構體。
    圖3顯示在人缺口1 NRR上之大鼠438表位之結構圖。
    圖4顯示在人缺口1 NRR上之大鼠351表位之結構圖。
    圖5顯示在人缺口1 NRR上之A2表位之結構圖。
    圖6顯示與大鼠438及A2抗體結合之缺口1 NRR之結構疊加。
    圖7顯示與大鼠351及A2抗體(顯示為分子表面)結合之缺口1 NRR(顯示為緞帶)之結構疊加。
    圖8顯示人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠438-mIgG1及A2抗體對人缺口1報告細胞中之缺口1依賴性傳訊的中和活性。
    圖9顯示人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠438-mIgG1及A2抗體對小鼠缺口1報告細胞中之缺口1依賴性傳訊的中和活性。
    圖10顯示大鼠351及A2抗體對人缺口1傳訊之中和活性。
    圖11顯示大鼠351及A2抗體對小鼠缺口1傳訊之中和活性。
    圖12顯示人化351變異體、大鼠351-mIgG1及A2抗體對人缺口1報告細胞中之缺口1依賴性傳訊的中和活性。
    圖13顯示人化351變異體、大鼠351-mIgG1及A2抗體對小鼠缺口1報告細胞中之缺口1依賴性傳訊的中和活性。
    圖14A及14B顯示大鼠351與缺口1 NRR之LNR-A區之間的交互作用介面之結構圖。
    圖15顯示大鼠351、突變大鼠351及A2於共培養報告基因試驗中之中和活性。
    圖16顯示以大鼠438、大鼠351、A2、僅對照培養基及抗VEGF抗體處理第10天之HUVEC芽生的CD31-Cy3免疫染色之代表性表螢光影像。
    圖17顯示血管生成之小鼠視網膜模型在經大鼠438-mIgG1、大鼠351-mIgG1、A2抗體、對照抗球蟲抗體及無處理之處理後的異凝集素B4-Alexa488染色之代表性共軛焦圖。
    圖18顯示產自接種於重組人DLL4配體並經濃度漸增之大鼠351、大鼠438、A2、及對照抗球蟲抗體處理之CCD1076SK人纖維母細胞的蛋白質萃取物之西方墨點分析。
    圖19顯示產自經漸增濃度之人化438 VH1.1/VL1.8、大鼠438-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理之HPB-ALL細胞的蛋白質萃取物之西方墨點分析。
    圖20顯示產自經漸增濃度之大鼠351-mIgG1、大鼠438-mIgG1、A2及對照抗球蟲抗體處理之T-ALL細胞系的蛋白質萃取物之西方墨點分析。
    圖21顯示以免疫組織化學檢測在37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植中之缺口1受體及Jagged1配體。
    圖22之層析圖顯示該37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植具有人K-ras基因之G13V突變。
    圖23顯示產自經大鼠438-mIgG1、A2及對照抗球蟲抗體處理之37622A1 NSCLC病患衍生性異種移植的蛋白質萃取物之西方墨點分析。
    圖24顯示產自經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理之87393A1 NSCLC病患衍生性異種移植的蛋白質萃取物之西方墨點分析。
    圖25顯示經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理後之87393A1 NSCLC病患衍生性異種移植中的內披蛋白表現之免疫組織化學檢測。
    圖26顯示經大鼠351-mIgG1及對照抗球蟲抗體處理後之87393A1 NSCLC病患衍生性異種移植中的內披蛋白表現之西方墨點分析。
    圖27顯示利用亞爾襄藍染色來自Calu-6療效試驗中之小鼠小腸的迴腸部分之分泌性杯狀細胞之組織化學識別，該小鼠係經大鼠438-mIgG1、A2或對照抗球蟲抗體之處理。
    圖28顯示來自Calu-6療效試驗中之小鼠小腸隱窩的抗Ki67免疫組織化學，該小鼠係經大鼠438-mIgG1、A2或對照抗球蟲抗體處理。
    圖29顯示來自87393A1病患衍生性異種移植療效試驗中之小鼠小腸隱窩的抗Ki67免疫組織化學，該小鼠係經大鼠351-mIgG1或對照抗球蟲抗體處理。
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    <220>
    <223> 合成性核苷酸序列
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    <400> 151
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    <212> DNA
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    <220>
    <223> 合成性核苷酸序列
    <400> 152
    权利要求:
    Claims (39)
    [1] 一種與缺口(Notch)1結合之抗體，其包含：重鏈可變區，該重鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：71之重鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    [2] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有源自包含SEQ ID NO：97之輕鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    [3] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：重鏈可變區，該重鏈可變區具有源自如SEQ ID NO：71所示之重鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區，及輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有源自如SEQ ID NO：97所示之輕鏈可變區的CDR1區、CDR2區及CDR3區。
    [4] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其包含與SEQ ID NO：71具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列。
    [5] 如申請專利範圍第4項之抗體，其包含如SEQ ID NO：71所示之重鏈可變區胺基酸序列。
    [6] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其包含與SEQ ID NO：97具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
    [7] 如申請專利範圍第6項之抗體，其包含如SEQ ID NO：97所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    [8] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其包含與SEQ ID NO：111具有至少90%一致性之重鏈胺基酸序列。
    [9] 如申請專利範圍第8項之抗體，其包含如SEQ ID NO：111所示之重鏈胺基酸序列。
    [10] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之抗體，其包含與SEQ ID NO：113具有至少90%一致性之輕鏈胺基酸序列。
    [11] 如申請專利範圍第10項之抗體，其包含如SEQ ID NO：113所示之輕鏈胺基酸序列。
    [12] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：與SEQ ID NO：71具有至少90%一致性之重鏈可變區胺基酸序列，及與SEQ ID NO：97具有至少90%一致性之輕鏈可變區胺基酸序列。
    [13] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：如SEQ ID NO：71所示之重鏈可變區胺基酸序列，及如SEQ ID NO：97所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    [14] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：與SEQ ID NO：111具有至少90%一致性之重鏈胺基酸序列，及與SEQ ID NO：113具有至少90%一致性之輕鏈胺基酸序列。
    [15] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：如SEQ ID NO：111所示之重鏈胺基酸序列，及如SEQ ID NO：113所示之輕鏈胺基酸序列。
    [16] 一種抗體，其與缺口1結合並與如申請專利範圍第1、2或3項之抗體競爭與缺口1結合。
    [17] 一種與缺口1結合之抗體或彼之抗原結合部分，其中該抗體與包含至少7個選自下列之胺基酸殘基之表位結合：Asn 1461、Lys 1462、Val 1463、Cys 1464、Leu 1466、Leu 1580、Tyr 1621、Gly 1622、Met 1670、Asp 1671、Val 1672、Arg 1673、Leu 1707、Ala 1708、Leu 1710、Leu 1711、Leu 1712、Leu 1713、Leu 1716及Leu 1718。
    [18] 如申請專利範圍第1至3及12至17項中任一項之抗體，其中該抗體係IgA、IgD、IgE、IgG或IgM分子或衍生自IgA、IgD、IgE、IgG或IgM之分子。
    [19] 如申請專利範圍第18項之抗體，其中該抗體係IgG或衍生自IgG，該IgG係選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之亞型。
    [20] 如申請專利範圍第19項之抗體，其中該亞型係衍生自IgG1。
    [21] 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1至20項中任一項之抗體。
    [22] 一種核酸，其包含如SEQ ID NO：112所示之序列。
    [23] 一種核酸，其包含如SEQ ID NO：114所示之序列。
    [24] 一種載體，其包含如申請專利範圍第21至23項中任一項之核酸。
    [25] 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第24項之載體。
    [26] 一種用於產製抗體之方法，其包含培養如申請專利範圍第25項之宿主細胞及自該培養基回收該抗體。
    [27] 一種宿主細胞，其重組產製如申請專利範圍第1至20項中任一項之抗體。
    [28] 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至20項中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
    [29] 如申請專利範圍第1至3及12至17項中任一項之抗體，其係用於治療。
    [30] 一種如申請專利範圍第1至20項中任一項之抗體於製造藥物之用途。
    [31] 如申請專利範圍第30項之用途，其中該用途係供需要治療之個體治療T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、非小細胞肺癌(NSCLC)及乳癌。
    [32] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：如SEQ ID NO：115所示之重鏈可變區胺基酸序列，及如SEQ ID NO：129所示之輕鏈可變區胺基酸序列。
    [33] 一種與缺口1結合之抗體，其包含：如SEQ ID NO：149所示之重鏈胺基酸序列，及如SEQ ID NO：151所示之輕鏈胺基酸序列。
    [34] 一種與人缺口1結合之抗體，其中該抗體與包含至少8個選自下列之胺基酸殘基之表位結合：Asp 1458、Asn 1461、Val 1463、Cys 1464、Leu 1466、Leu 1580、Met 1581、Pro 1582、Tyr 1621、Gly 1622、Arg 1623、Asp 1671、Val 1672、Arg 1673、Gly 1674、Leu 1710、Gly 1711、Ser 1712、Leu 1713、Asn 1714、Ile 1715、Pro 1716及Lys 1718。
    [35] 一種抗體，其相較於對天然缺口1受體之缺口1活化的抑制顯示較高之對突變缺口1受體之缺口1活化的抑制。
    [36] 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第32至35項中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
    [37] 如申請專利範圍第32至35項中任一項之抗體，其係用於治療。
    [38] 一種如申請專利範圍第32至35項中任一項之抗體於製造藥物之用途。
    [39] 如申請專利範圍第38項之用途，其中該用途係供需要治療之個體治療T細胞急性淋巴胚細胞白血病(T-ALL)、非小細胞肺癌(NSCLC)及乳癌。
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    法律状态:
    2019-11-01| MM4A| Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US42357810P| true| 2010-12-15|2010-12-15||
    US201161552578P| true| 2011-10-28|2011-10-28||
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